Estudi de l'efecte de l'entorn i de mutacions en l'estructura i estabilitat del receptor acoblat a proteïna G rodopsina

La rodopsina es el fotoreceptor visual responsable de la visio a baixa intensitat luminica que es troba en les cel·lules basto de la retina. Aquesta proteina es el model per excel·lencia de la superfamilia de receptors acoblats a proteina G (GPCR), que estan constituits per 7 helices transmembrana, i que tenen un gran interes farmacologic. La rodopsina es l'unic membre de la superfamilia l'estructura del qual s'ha determinat per difraccio de Raigs X. El seu estudi es de vital importancia per determinar aquells motius estructurals comuns als GPCR, aixi com per contribuir a l'elucidacio dels trets basics d'un mecanisme d'activacio comu. A mes, l'estudi de mutacions en rodopsina associades a malalties de la retina com la retinosi pigmentaria (RP) i la ceguesa nocturna congenita (CNC), ha de permetre determinar les bases moleculars d'aquestes patologies. L'objectiu principal d'aquesta tesi es aprofundir en l'estudi dels determinants estructurals de l'estabilitat, aixi com tambe contribuir a desxifrar els mecanismes moleculars de la RP i la CNC. Per aixo s'ha estudiat l'efecte de factors externs, com la unio de cations (en particular del zenc), i l'estat de l'entorn lipidic (alterant la concentracio del detergent dodecil maltosid) en l'estabilitat de diferents estats de la rodopsina i del seu cromofor. Tambe s'ha determinat com afecten l'estabilitat i la conformacio de la rodopsina mutacions puntuals associades a la CNC, T94I, i a la RP, L46R; i a la xarxa electrostatica present entre la part citoplasmatica de les helices 3 i 6 mitjancant la construccio de mutants senzills, dobles i triples en les posicions 134, 247 i 251, els quals s'ha vist que estan implicats en el canvi conformacional de pas a la forma activa. Els mutants s'han obtingut mitjancant tecniques de DNA recombinant, les proteines mutades s'han expressat en cel·lules COS-1, immunopurificat amb l'anticos monoclonal Rho-1D4, i caracteritzat per espectrofotometria UV-visible. Els resultats obtinguts demostren que el zenc s'uneix de manera especifica a la rodopsina, disminuint la seva estabilitat termica i la seva capacitat d'unir 11-cis-retinal. Tambe s'ha demostrat que la temperatura provoca la isomeritzacio especifica de l'11-cis-retinal a tot-trans-retinal quan aquest es troba unit a rodopsina pero no quan es troba lliure en solucio. Aixo reforca la idea de la interaccio optima present entre els aminoacids de la butxaca del retinal i el cromofor. Pel que fa a l'estudi de l'efecte de l'entorn lipidic en l'estructura i estabilitat de la rodopsina, s'ha mostrat que elevades concentracions de detergent desestabilitzen la conformacio activa (Metarodopsina II) pero promouen la formacio d'un fotointermediari inactiu (Metarodopsina III). El detergent, doncs, juga un paper molt important en el desplacament de l'equilibri entre els diferents fotointermediaris. En el cas dels mutants associats a malalties de la retina, la mutacio T94I disminueix l'estabilitat de la conformacio inactiva pero estabilitza enormement la conformacio activa, indicant un paper rellevant de la T94 en l'estabilitzacio d'una xarxa electrostatica en l'entorn de la base de Schiff. La mutacio L46R en la helix 1 i causant de la RP impedeix que la proteina es processi correctament i arribi a la membrana. Aquest resultat posa emfasi per primera vegada en la importancia de l'helix 1 per a l'estructura de la rodopsina i probablement per altres GPCR. L'estudi dels mutants en les posicions 134, 247 i 251 en la part citoplasmatica de les helices 3 i 6 ha confirmat que aquestes posicions son importants per a l'estabilitat de la conformacio inactiva de la rodopsina. Es proposa una paper central de la posicio 251 en l'estructura i l'estabilitat de la xarxa eletrostatica que implica aquestes posicions.