Los genes angulata7 y orbiculata1 participan en la biogénesis del cloroplasto y la organogénesis foliar en arabidopsis

Con el fin de identificar y caracterizar genes implicados en el desarrollo foliar de Arabidopsis, hemos estudiado en esta Tesis los mutantes angulata7-1 (anu7-1), orbiculata1-1 (orb1-1), orb1-2 y orb1-3, obtenidos en el laboratorio de J.L. Micol mediante tratamiento de la estirpe silvestre Landsberg erecta (Ler) con metanosulfonato de etilo. Las hojas vegetativas de anu7-1 son palidas y dentadas. El tamano de la roseta y la estatura de las plantas adultas de este mutante son menores que los de Ler. Sus niveles de clorofilas y carotenoides son inferiores a los silvestres. El mesofilo en empalizada de anu7-1 presenta celulas de tamanos irregulares y grandes espacios intercelulares. Las membranas tilacoidales de sus cloroplastos estan parcialmente desapiladas. Hemos identificado en el mutante anu7-1, mediante clonacion posicional, una mutacion puntual en At5g53860, un gen nuclear de copia unica que codifica una proteina de los nucleoides de los cloroplastos. La proteina ANU7 presenta dos de los cuatro motivos C-X-X-C-X-G-X-G que caracterizan al dominio rico en cisteina (CR) de las proteinas DnaJ, que esta conservado en la mayoria de las plantas terrestres, excepto en las gimnospermas y las gramineas. Hemos confirmado que At5g53860 es ANU7 mediante ensayos de alelismo entre anu7-1 y dos lineas insercionales. Tambien hemos comprobado que el transgen 35Spro:At5g53860 restablece completamente el fenotipo silvestre en las plantas anu7-1. La visualizacion de la expresion de un transgen At5g53860pro:GUS indica que ANU7 se expresa en todos los tejidos y estados de desarrollo estudiados. Hemos analizado el transcriptoma de anu7-1 en micromatrices. Los genes nucleares sobreexpresados en anu7-1 incluyen 7 de los que codifican componentes del complejo plastid transcriptionally active chromosome (pTAC) del cloroplasto. La sobreexpresion de estos genes puede ser una respuesta del nucleo a la senal retrograda emitida por el cloroplasto como consecuencia de la disfuncion de este organulo causada por la mutacion anu7-1. En este mutante tambien se sobreexpresan algunos genes del genoma del cloroplasto transcritos por la polimerasa de ARN codificada por el nucleo (NEP, de nuclear-encoded RNA polymerase) y ninguno de los que dependen solamente de la polimerasa de ARN codificada por el cloroplasto (PEP, de plastid-encoded RNA polymerase), lo que sugiere que ANU7 participa en el ensamblaje de la maquinaria transcripcional del cloroplasto. Hemos estudiado las interacciones geneticas entre anu7-1 y alelos mutantes de GENOMES UNCOUPLED 1 (GUN1), que esta implicado en la senalizacion retrograda del cloloroplasto al nucleo. El fenotipo morfologico del doble mutante anu7-1 gun1-1 es sinergico: el margen de sus hojas es entero y en su mesofilo en empalizada se normaliza el tamano de las celulas y no se observan espacios intercelulares. Las hojas anu7-1 gun1-1 son variegadas, con sectores de diferentes grados de pigmentacion, lo que sugiere que la ausencia de ANU7 y GUN1 potencia ciertas actividades de los cloroplastos, restableciendose la morfologia normal de la hoja pero alterandose localmente la funcion de este organulo y la distribucion espacial de las clorofilas. Las mutaciones orb1 tambien reducen el tamano de la roseta y las hojas vegetativas, que son palidas, con niveles de clorofilas y carotenoides inferiores a los de Ler. Las celulas del mesofilo en empalizada de los mutantes orb1 son menores que las silvestres, pero el cociente entre su tamano y el de la superficie de la hoja es similar al de Ler. Hemos establecido que ORB1 es At5g04140 combinando el analisis iterativo del ligamiento a marcadores moleculares y la secuenciacion masiva. At5g04140 es un gen previamente descrito, que codifica una glutamato sintasa dependiente de ferredoxina, localizada en los cloroplastos: esta enzima sintetiza glutamato y 2-oxoglutarato a partir de glutamina y amonio. Hemos confirmado la identidad de ORB1 mediante un ensayo de alelismo con un mutante insercional y hemos generado una construccion At5g04140pro:GUS para visualizar el patron de expresion de ORB1, que es generalizado. Hemos secuenciado masivamente el ARN de orb1-3. Varios de los genes que hemos encontrado desregulados en las rosetas de este mutante estan relacionados con el metabolismo del nitrogeno y la biosintesis de aminoacidos, lo que sugiere que su expresion depende de los niveles de glutamato y/o glutamina. Tambien se sobreexpresan de manera concertada muchos genes que codifican proteinas ribosomicas. Esta observacion sugiere una respuesta compensatoria de la celula ante el deficit de glutamato, a fin de incrementar la sintesis de proteinas. Hemos generado herramientas para el estudio de las funciones postembrionarias de genes letales embrionarios (EMB, de embryo defective) mediante analisis clonal. Hemos empleado las lineas CAUT (de cell autonomy) para obtener lineas transgenicas con el genotipo apropiado para el estudio de 24 genes EMB. Estas lineas pueden ser irradiadas con rayos X y examinadas posteriormente para encontrar sectores mutantes que manifiesten los efectos de la ausencia de la funcion de los genes a estudio en tejidos postembrionarios. Tambien hemos adaptado el vector pCB1 a la tecnologia Gateway, generando construcciones para el estudio de las funciones postembrionarias de 20 genes letales embrionarios mediante la escision, mediada por la recombinasa Cre, de una copia EMB silvestre inserta en el genoma de plantas homocigoticas para los correspondientes alelos nulos emb.