Tissue Engineering mit Hyaluronsäure-Gelatine-Kompositmatrices zusätzlich stabilisiert mit Gelatine und Transglutaminase

Das Tissue Engineering im Bereich avaskularer Meniskuslasionen beinhaltet eine in vitro Kultivierung und Differenzierung von autologen Zellen in einem Scaffold und die anschliesende Implantation in den Meniskusdefekt. Eine im eigenen Labor als solches Scaffold entwickelte Hyaluronsaure-Gelatine-Komposit-Matrix soll durch zusatzliches Einbringen von Gelatine und Transglutaminase mechanisch stabilisiert werden. Zur Messung der Stabilitat der mit Transglutaminase enzymatisch quervernetzten Gelatine bestimmten wir unter anderem einen Wert fur die Arbeit zur Kompression des Gels in einer Well-Platte mit Hilfe eines umfunktionierten Infusiomaten und eines ausgesuchten Stempels. Auserdem erfolgten Kompressionen von freien Gel-Zylindern und Matrices – bei Messung der Matrices zusatzlich auch Zugbelastungen. Zur Bestimmung der enzymatischen Aktivitat bevorzugten wir eine Fluoreszenz-Messung mit Kasein und Dansylcadaverin als Substrate. Unter Verwendung einer Meerschweinchentransglutaminase von Sigma als Standardtransglutaminase konnten wir die Aktivitat der Transglutaminasen dosieren und unter verschiedenen Einflussfaktoren uberprufen. Fur die meisten mechanischen Versuche verwendeten wir eine bakterielle Transglutaminase von Ajinomoto. Um eine moglichst feste Gelstruktur herzustellen, erwies es sich als vorteilhaft, die enzymatische Quervernetzung fur mindestens 24 Stunden bei 4 °C stattfinden zu lassen. Eine bis zu 24-stundige Kalteexposition der mesenchymalen Stammzellen in Form einer 3-D-Kultur in der quervernetzten Gelatine stellte bei 28-tagiger Nachbeobachtung keine relevante negative Auswirkung auf die Uberlebensrate und das metabolische Wachstum dar. Eine Zellproliferation zeigte sich bei allen Gruppen unabhangig von der Kalteexposition kaum. Die Zellmorphologie zeigte die Ausbildung von Pseudopodien. Nach 28 Tagen ergaben sich Hinweise fur eine osteogene Differenzierung. Insgesamt konnten die Zellen gut und in homogener Anordnung in der Gelatine stabilisiert werden. Weitere Einflussfaktoren, wie die Konzentrationen der Gelatine, der Transglutaminase, des bei Ajinomoto enthaltenden Maltodextrin-Zucker und des fetalen bovinen Serum zeigten bei hoheren Konzentrationen keine negativen, sondern zum Teil sogar positive Auswirkungen auf Zellvitalitat und –wachstum. Das Einbringen einer Gelatine-Transglutaminase-Losung in die Poren der Hyaluronsaure-Gelatine-Komposit-Matrix und die anschliesende Inkubation bei 4°C zeigte eine erhebliche Verbesserung der mechanischen Stabilitat bei Kompression und Zugbelastung, sogar noch verstarkt durch zusatzliche Vorbehandlung der Matrices mit Transglutaminase, so dass eine zusatzliche Dosis von Transglutaminase an die Matrix vorweg adharieren konnte. Bei Kompressionen konnte etwa eine Verzehnfachung des E-Modul erreicht werden. Die maximale Zugbelastung konnte ungefahr verdoppelt werden. Die Zugdehnung wurde ebenfalls verbessert. Insgesamt konnte festgehalten werden, dass durch die Einbringung von quervernetzter Gelatine eine Verbesserung von Materialeigenschaften gelang, die bei den herkommlichen Matrices unbefriedigend waren. Hohere Konzentrationen von Gelatine und Transglutaminase als die von uns gewahlten maximalen Konzentrationen von 5% bzw. 3 U/ml waren wunschenswert, stellten allerdings ein Handhabungsproblem dar, insbesondere in Bezug auf das rechtzeitige Einbringen der Gelatine-Transglutaminase-Losung in die Matrix vor dem Zah-Werden und schlieslich Hart-Werden der Losung.