Avaliação da participação das células NK (células CD56+) na resposta ao paracoccidioides brasiliensis

Tradicionalmente o papel das celulas NK na resposta imunologica tem sido associado com a resistencia a infeccao viral e tumores, porem estudos recentes apontam para a participacao destas celulas na resposta imunologica contra outras doencas infecciosas. O objetivo deste estudo foi avaliar a possivel participacao de celulas NK (CD56+CD3-) na resposta imunologica ao fungo Paracoccidioides brasiliensis. Foram utilizadas celulas CD56+ isoladas por meio imunomagnetico provenientes de pacientes com paracoccidioidomicose e de individuos controle. As celulas CD56+ foram avaliadas quanto a capacidade citotoxica direta contra leveduras de P. brasiliensis (cepa virulenta – Pb18 e avirulenta – Pb265) e contra celulas-alvo (monocitos) infectadas com leveduras de ambas as cepas. Tambem foi avaliada a expressao dos constituintes dos grânulos citotoxicos (granzima A, B, perforina e granulisina), receptores de ativacao (NKG2D) e de inibicao (KIR2DL2/L3/S2 e KIR3DL1), marcadores de ativacao (CD69 e CD25), assim como a producao de citocinas (IFN-g e TNF-a) por meio de PCR em tempo real e por citometria de fluxo. A participacao da IL-15 na ativacao das celulas NK foi avaliada pela adicao da citocina recombinante em alguns experimentos. Para avaliar a participacao dos grânulos na atividade citotoxica direta e contra celulas-alvo em alguns experimentos as celulas foram tratadas com inibidores especificos (SrCl, concanamicina A ou EGTA). Os resultados demonstraram que celulas de pacientes apresentam resposta citotoxica (direta e contra celulas-alvo) inferior aquela observada nos individuos controle. A citotoxicidade direta foi dependente de grânulos, mas independente de perforina, enquanto que a citotoxicidade contra celulas-alvo foi dependente de perforina. A expressao de granulisina (RNAm e proteina) foi maior nas celulas de individuos controle. Alem disso, observamos que celulas CD56+ apresentam a capacidade de secretar essa proteina apos o estimulo com leveduras de P. brasiliensis. Tambem observamos que as celulas CD56+ de doadores normais sao ativadas (aumentam a expressao de CD69 e CD25) quando estimuladas com o fungo, enquanto as celulas NK de pacientes nao mostraram esse aumento, a nao ser quando estimuladas com IL-15. Estes resultados demonstraram que as celulas CD56+ podem participar ativamente da resposta imunologica contra o P. brasiliensis, podendo contribuir tanto para a morte direta do fungo como de celulas infectadas, e que a granulisina pode desempenhar um papel preponderante no controle da infeccao pelo P. brasiliensis. Outro fato importante observado foi que as celulas CD56+ quando estimuladas por celulas leveduriformes de P. brasiliensis produzem e secretam IFN-g, uma citocina com atuacao importante na ativacao de outras celulas do sistema imunologico como macrofagos e linfocitos, e dessa forma pode contribuir para o desenvolvimento da resposta imunologica adquirida subsequente a infeccao. Abstract