Exploration de la face cachée du métabolisme bactérien chez Acinetobacter baylyi ADP1

La connaissance du metabolisme demeure incomplete mais sa comprehension reste un but majeur tant pour la recherche fondamentale qu’appliquee. Environ 40% des genes des organismes procaryotes n’ont pas de fonction precise proposee. En consequence, de nombreuses voies metaboliques sont incompletes et d’autres restent a decouvrir. Ces lacunes rendent tres difficile la modelisation et la comprehension du metabolisme d’une cellule. Le laboratoire developpe une nouvelle strategie pour mettre au jour des voies metaboliques inconnues. Celle-ci est basee sur la bacterie modele du laboratoire, Acinetobacter baylyi ADP1 (AP1). Elle exploite la banque complete de mutants de deletion de cet organisme (2600 mutants) ainsi que les avancees recentes du laboratoire dans le domaine de la metabolomique par chromatographie liquide couplee a la spectrometrie de masse a tres haute resolution (LC/MS).Cette etude est liee a l’observation que lors d’un changement de source de carbone (succinate vs quinate) ADP1 produit de nombreux metabolites d’identite inconnue, non relies a notre connaissance de son metabolisme. Ces metabolites orphelins (MO) participent a des voies metaboliques nouvelles et representent des points d’entree dans la partie obscure du metabolisme bacterien.Ce projet comporte deux volets. Il s’agit d’une part de proceder a l’elucidation structurale des MO et d’autre part d’identifier l'ensemble des genes impliques dans leur synthese.Dans le cadre de ce travail de these, nous avons etabli l’identite d’un premier MO : l’acide 3-(3-aminopropylamine)- 4-hydroxybenzoique. Ce compose est un bien metabolite nouveau, jamais reference auparavant. Dans un premier temps, des experiences de LC/MS impliquant notamment des fragmentations sequentielles MSn et des echanges isotopiques H/D ont permis de determiner sa composition elementaire, son nombre de protons echangeables et ont suggere une structure aromatique de la molecule. Ensuite, son identification a necessite sa purification a l’echelle de la centaine de µg. Puis, une analyse RMN complete (1H, 13C, COSY, 1H-13C HSQC, 1H-13C HMBC, et 1H-15N HMBC) a permis de preciser sa structure.Par ailleurs, pour identifier les genes impliques dans la synthese des MO, nous avons procede a l’analyse metabolomique de l’ensemble des mutants de la collection d’ADP1. Pour cela, nous avons developpe des protocoles a haut-debit pour la preparation des metabolomes (100 metabolomes par jour), l’acquisition des donnees LC/MS (8 minutes par acquisition) et enfin leur analyse automatisee. Nous regardons, pour chaque mutant, quels sont les MO presents et absents. L’absence d’un MO chez un mutant donne indique que le gene excise est implique dans sa synthese. L’analyse systematique de la banque doit permettre in fine de dresser la liste de tous les genes impliques dans la synthese de chaque MO. Les resultats du criblage, toujours en cours, permettront ainsi de commencer a reconstituer ces voies metaboliques nouvelles.