Pseudomonas putida als Zellfabrik zur Produktion von Rhamnolipiden

Rhamnolipide sind mikrobielle Tenside, die aufgrund vielversprechender Eigenschaften als Alternative zu den kommerziell weit verbreiteten Erdol-basierten Tensiden angesehen werden. Die biotechnologische Anwendbarkeit von Rhamnolipiden wird derzeit unter anderem durch die naturliche komplexe Regulation der Biosynthese, die Pathogenitat oder die schwierige technologische Zuganglichkeit von Ursprungsorganismen erschwert. Als vielversprechende Alternative wurde Pseudomonas putida KT2440 in der Vergangenheit fur die heterologe Produktion von Rhamnolipiden etabliert. Bislang wurden in entsprechenden Studien uberwiegend Plasmide mit starken synthetischen Promotoren zur Expression des fur die Produktion von Monorhamnolipiden (mRL) kodierenden rhlAB-Operons verwendet. Im Gegensatz dazu gelten im Allgemeinen genomintegrierte Expressionskassetten als besser geeignet zur Konstruktion von stabilen Produktionsstammen. Die Ziele dieser Arbeit bestanden darin, (i) Werkzeuge zur schnellen und effizienten Konstruktion stabiler P. putida-Produzenten bereitzustellen, (ii) die Rhamnolipid-Produktion in verschiedenen Stammen zu charakterisieren, (iii) anschliesend den Produktionstiter zu optimieren sowie schlieslich (iv) die Breite des Anwendungspotenzials der selektierten Expressionskassette zu evaluieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zunachst die attTn7-Integration vermittelnde Transfer- und Expressions- (yTREX) toolbox entwickelt sowie der Victoria Pure Blue BO-Assay zur Tensid-Detektion etabliert. Diese neuen Werkzeuge ermoglichten die effektive Konstruktion eines Sets an Stammen mit neuen Expressionskassetten und die in dieser Form erstmalig durchgefuhrten komparativen Expressionsstudien mit verschiedenen Promotoren zur Untersuchung von deren Einfluss auf die Genexpression, Stammstabilitat, Produktivitat und den Rhamnolipid-Titer (i). Bemerkenswerterweise ging bei der Verwendung starker, konstitutiver Promotoren die Fahigkeit zur Bildung von Rhamnolipiden verloren, was auf einen negativen Selektionsdruck durch Rhamnolipid-Produktion hindeutete. Die Induktor-gesteuerten Expressionssysteme, hier erstmalig im Kontext der Rhamnolipid-Biosynthese angewendet, zeigten dagegen eine effiziente Zielgenexpression verbunden mit einer herausragenden Stabilitat der Produktionsstamme (ii). Insgesamt fuhrte das Salicylat-induzierbare, PnagAa-vermittelte rhlAB-Expressionssystem zu den besten Produktionseigenschaften. Die Optimierung des Rhamnolipid-Titers und die vollstandige Umsetzung der Vorstufe HAA konnte durch Verwendung eines genomreduzierten Stammhintergrunds, und auch durch heterologe Koexpression relevanter Edukt-Synthasen erreicht werden. Im (Mikro )Batch-Masstab zeigte der finale Produzent P. putida KTsalmRL+Rha+G1P einen mRL-Titer von 1,45 g/L bei einer Induktorkonzentration von 2 mM Salicylat (iii). Abschliesend konnte die breitere Anwendbarkeit dieses Expressionssystems durch Produktion von unterschiedlichen Rhamnolipid-Kongeneren gezeigt werden (iv). Zusammenfassend konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit erstmals eine Induktor-basierte Expression von stabil in das bakterielle Genom integrierten rhlAB-Genen und eine damit vielversprechende Rhamnolipid-Produktion gezeigt werden. Die neu konstruierte Expressions-toolbox sowie der VPBO Assay tragen auch uber die konkrete Anwendung in diesem Kontext hinaus zur Etablierung von mikrobiologisch produzierten Sekundarmetaboliten als ein Baustein auf dem Weg zu einer Bio basierten Okonomie bei.