Explorer les voies de l’ARN interférence par initiation in planta pour dévoiler la fonction des gènes chez le riz (Oryza sativa L. ) et le cacaoyer (Theobroma cacao L. )

Decouvrir la fonction de l'ensemble des genes vegetaux est devenue une priorite depuis l'avenement des methodes recentes de sequencage. Outre le nombre sans cesse croissant de genomes entierement sequences, a l'image de celui du riz, le nombre de sequences exprimees disponibles, ADNc et EST, est lui aussi en augmentation constante. C'est notamment le cas pour le cacaoyer (Theobroma cacao L.) a travers un projet de sequencage d'EST realise entre le CIRAD et le Genoscope (Argout et al., 2008), qui a permis de generer 149 650 ESTs, et un sequencage complet du genome prevu dans les prochaines annees. L'analyse bioinformatique de ces sequences a permis de reperer plusieurs genes candidats potentiellement impliques dans la resistance aux pathogenes, ou encore dans la qualite de la feve. La masse de donnees issue de ces programmes de sequencage necessite maintenant de pouvoir disposer de methodes efficaces a haut debit pour l'analyse fonctionnelle des genes identifies. Plusieurs techniques sont actuellement utilisees avec succes pour determiner la fonction des genes chez les plantes, mais la plupart d'entres elles impliquent l'utilisation de la transformation genetique stable, a l'image de la technologie d'inactivation de l'expression des genes basee sur l'ARN interference. Cette technique est couramment utilisee en genomique fonctionnelle car elle permet d'analyser avec efficacite et de maniere ciblee la fonction des genes. Ces travaux de these avaient pour objectif de developper un nouvel outil de genomique fonctionnelle permettant d'etudier la fonction des genes avec efficacite et rapidite, sans avoir recours a la transformation genetique stable, en adaptant la technique d'agroinfection in planta pour initier et propager le mecanisme de l'ARNi dans la plante. La premiere etape de ces recherches a consiste a mettre au point une methode d'expression transitoire de genes dans les feuilles de riz et de cacaoyer par agro-infection. Si l'agro-infection in planta de cellules de feuilles de cacaoyer a ete relativement aisee a obtenir en adaptant a cet arbre la methode d'agro-infiltration de N. benthamiana, aucune technique equivalente n'existait pour les cereales. L'agro-infection in planta du riz a donc necessite de developper un protocole original, efficace et reproductible. Une fois la technique d'expression transitoire de gene validee pour ces deux especes, des experiences d'extinction de genes ciblees par ARNi ont ete effectuees pour trois genes endogenes pin1, chs et slr1, ainsi qu'un transgene gusA pour le riz, et pour trois endogenes pin], chs et pds pour le cacaoyer. Pour tous les genes cibles, il a ete possible d'induire l'ARNi dans les cellules vegetales. Apres son initiation in planta. l'ARN interference se maintient dans les tissus agro-infectes, ce qui conduit a une diffusion passive des siRNA dans les tissus situes autour de la zone agro-infectee, sans pour autant conduire a la mise en place d'un signa! systemique permettant au mecanisme d'extinction de se propager dans l'organisme. Sur la base de ces resultats, une serie d'experiences a ete initiee dans le tabac pour identifier les conditions necessaires a la mise en place d'un tel signal systemique, et developper un nouveau protocole d'agro-infection des plantes d'interet. (Resume d'auteur)