Function and Global Distribution of Polyethylene Terephthalate (PET)-Degrading Bacteria and Enzymes in Marine and Terrestrial Metagenomes

The goals of this work were (i) enhancing the known biodiversity of PET hydrolase containing microorganisms, since a clear overrepresentation of sequences from the phylum Actinobacteria was observed, (ii) mapping the results on a global scale therefore, giving the possibility to recognize a greater context and (iii) the production of selected PET hydrolases for subsequent biochemical characterizations. Enrichment and functional screening methods were applied in order to identify enzymes with activity on polymeric substrates. The combination of enrichment of environmental samples and functional screening of 78,897 metagenomic fosmid clones resulted in a single open reading frame (ORF) which proofed to encode a hydrolase capable of diethyl phthalate breakdown. In further tests the enzyme did not show any activity on PET. Therefore, an alternative screening method had to be applied. For this a sequence based deep data mining for putative PET hydrolase sequences was established. As initial tool for the sequence mining a HMM was constructed based on alignments of nine known PET hydrolase sequences. The model was applied on the NCBI and UniProt databases which resulted in 1,187 and 504 sequences respectively. These sequences were affiliated with the phyla Actinobacteria, Proteobacteria, Bacteroidetes, Deinococcus-Thermus and Cyanobacteria. The new sequences were filtered according to their scores (>180) and reintegrated into the alignment for the HMM. Besides the database derived sequences, metagenomic sequences were screened as well. A total of 133 Public available metagenomic datasets (>16 Gb of assembled DNA sequence) were obtained from IMG and used to map potential hits to the samplesites geographical data. The phylogenetic distribution was in this case slightly larger containing sequences from the before mentioned phyla of the domain Bacteria with the addition of Verrucomicrobia, Spirochaetes, Lentisphaerae, Firmicutes and Acidobacteria as well as phyla from Archaea (Euryarchaeota, Candidatus Thorarchaeota, Candidatus Lokiarchaeota) and Eukaryota (Pelagophyceae, Haptophyceae, Chromerida). The metagenomic data of terrestrial and marine derived samples were compared and revealed differences in the phylogenetic composition. In marine samples Bacteroidetes was the dominant phyla whereas Actinobacteria dominated terrestrial habitats. Further in the terrestrial dataset the sequence data of a crude oil associated sample was outstanding in terms of putative PET hydrolase sequence abundance. This samplesite contained 135 potential PET hydrolase sequences accounting to a frequency of 1.5 hits/Gb suggesting enrichment of such enzymes and bacteria whereas all other sampled metagenomes showed an frequency of less than 1 hit/Gb. To verify the HMM on a functional level four database derived sequences were chosen due to their phylogenetic origin. The sequences were cloned and the expressed in E. coli resulting in sufficient amount of active enzyme (PET2, PET5, PET6 and PET12) for an initial characterization. These PET hydrolases showed activity on diethyl phthalate (DEP), polycaprolactone (PCL) as well as on PET nanoparticles. To our surprise, PET2 and PET6 also showed activity at elevated temperatures of up to 90 °C, along with some solvent stability, these enzymes are good candidates for industrial applications. Altogether the applied self-constructed Hidden Markov model (HMM) allowed the identification of conserved motifs connected to PET activity of hydrolases. Using combined approaches the biodiversity of known PET degrading bacterial phyla was significantly enriched. Furthermore the PET hydrolase distribution was displayed in a global context. The obtained data indicate that PET hydrolases also occur in other phyla besides the already PET hydrolase associated Actinobacteria, whereby Bacteroidetes and Actinobacteria are the dominant phyla for marine and terrestrial metagenomes respectively, followed in both cases by Proteobacteria. The cloned and expressed enzymes showed activity on PET nanoparticles and other substrates, while being highly stable at elevated temperatures and under the influence of solvents, detergents and other inhibitors. The in this work developed strategies can now be used as the basis for further development of recycling-technologies and other methods intending to modify or partial degrade PET or other synthetic as well as natural polymers. Die Ziele dieser Arbeit waren (i) die Erhohung der bekannten Biodiversitat von PET-Hydrolase assoziierten Mikroorganismen, da in der Vergangenheit eine deutliche Uberreprasentation von Sequenzen aus dem Phylum Actinobacteria beobachtet werden konnte, (ii) die Ergebnisse in einem globalen Kontext zu stellen, wodurch es moglich ist grosere Zusammenhange zu erkennen und (iii) ausgewahlte potentielle neue PET hydrolasen in E. coli zu produzieren, fur anschliesende biochemische Charakterisierungen. Um diese Ziele zu erreichen wurden zwei Losungsansatze gewahlt. Anreicherungen und funktionelle Screening-Methoden wurden angewendet um Enzyme mit Aktivitat auf polymeren Substraten zu identifizieren. Die Kombination von Anreicherungen von Umweltproben und funktionellem Screening von 78.897 metagenomischen Fosmidklonen resultierte in einem einzelnen ORF, der nachweislich fur eine Hydrolase kodiert mit der Fahigkeit Diethylphthalat abzubauen. In weiteren Tests zeigte das Enzym keine Aktivitat auf PET. Daher wurde eine alternative Screening-Methode angewendet. Hierzu wurde ein sequenzbasiertes „Deep Data Mining“ fur mogliche PET-Hydrolase Sequenzen etabliert. Als Grundlage fur das Sequenz-Mining wurde ein HMM, basierend auf Alignments von neun bekannten PET-Hydrolase-Sequenzen, konstruiert. Das Modell wurde auf die NCBI- und UniProt-Datenbanken angewendet, was zu 1.187 bzw. 504 Sequenzen fuhrte. Diese Sequenzen wurden den Phyla Actinobacteria, Proteobacteria, Bacteroides, Deinococcus-Thermus und Cyanobacteria zugeordnet. Die neuen Sequenzen wurden nach „Bit-scores“ gefiltert (>180) und in die bestehenden Alignments fur das HMM reintegriert. Neben den aus Datenbanken bezogenen Sequenzen wurden auch metagenomische Sequenzen durchsucht. Insgesamt 133 offentlich verfugbare metagenomische Datensatze (>16 Gb assemblierte DNA-Sequenz) wurden von IMG bezogen um mit Hilfe der geographischen Metadaten potentielle PET Hydrolyse Treffer in einer Weltkarte abzubilden. Die phylogenetische Verteilung war in diesem Fall etwas groser und enthielt Sequenzen aus den zuvor erwahnten Phyla der Domane Bacteria. Zusatzlich waren Verrucomicrobia, Spirochaetes, Lentisphaerae, Firmicutes und Acidobacteria vertreten. Auserdem Phyla aus Archaea (Euryarchaeota, Candidatus Thorarchaeota, Candidatus Lokiarchaeota) und Eukaryota (Pelagophyceae, Haptophyceae, Chromerida). Die metagenomischen Daten von terrestrischen und marinen Proben wurden verglichen und zeigten Unterschiede in der phylogenetischen Zusammensetzung. In marinen Metagenomen war Bacteroidetes das dominante Phylum, wahrend das Phylum Actinobacteria terrestrische Habitate dominierte. Auffallig war ein terrestrisches Metagenom einer Rohol assoziierten Probe im Hinblick auf die Haufigkeit von PET-Hydrolase Sequenzen. Dieses Metagenom enthielt 135 potentielle PET-Hydrolase Sequenzen, was einer Haufigkeit von 1,5 Hits/Gb entspricht. Diese im Vergleich zu den anderen Metagenomen (<1 Hit/Gb) hohe Anzahl von putativen PET-Hydrolase Sequenzen konnte auf eine Anreicherung solcher Enzyme und Bakterien hindeuten. Um das HMM auf funktionaler Ebene zu verifizieren, wurden aufgrund ihrer phylogenetischen Herkunft vier Sequenzen ausgewahlt. Die Sequenzen wurden kloniert und in E. coli exprimiert, was zu einer ausreichenden Menge an aktivem Enzym (PET2, PET5, PET6 und PET12) fur eine anfangliche Charakterisierung fuhrte. Diese PET-Hydrolasen zeigten Aktivitat auf DEP, PCL sowie auf PET-Nanopartikeln. Zu unserer Uberraschung zeigten PET2 und PET6 auch Aktivitat bei erhohten Temperaturen von bis zu 90 °C, zusammen mit einer gewissen Losungsmittelstabilitat machen diese Eigenschaften die beiden Enzyme zu guten Kandidaten fur industrielle Anwendungen. Insgesamt ermoglichte das verwendete selbst konstruierte Hidden-Markov-Modell (HMM) die Identifizierung von konservierten Motiven, die mit der Aktivitat von PET-Hydrolasen verbunden sind. Mit verschiedenen experimentellen Methoden wurde die Biodiversitat bekannter PET-abbauender Bakterienstamme signifikant erhoht. Daruber hinaus wurde die Verteilung von PET-Hydrolase in einem globalen Kontext dargestellt. Die gewonnenen Daten zeigen, dass PET-Hydrolasen auch in anderen Phyla neben den bereits mit PET-Hydrolase assoziierten Actinobacteria vorkommen, wobei Bacteroidetes und Actinobacteria die dominanten Phyla fur marine bzw. terrestrische Metagenome sind, gefolgt in beiden Fallen von Proteobacteria. Die heterolog produzierten Enzyme zeigten eine Aktivitat auf PET-Nanopartikeln und anderen Substraten, wahrend sie bei erhohten Temperaturen und unter dem Einfluss von Losungsmitteln, Detergenzien und anderen Inhibitoren hohe Stabilitat zeigten. Die in dieser Arbeit entwickelten Strategien konnen nun als Grundlage fur die Weiterentwicklung von Recycling-Technologien und anderen Methoden verwendet werden, die darauf abzielen, PET oder andere synthetische sowie naturliche Polymere zu modifizieren oder teilweise abzubauen.