Fosfatases de Daphnia similis como biomarcadores da ecotoxicidade de agroquímicos

Daphnia similis e um microcrustaceo da familia dos cladoceros que se encontra amplamente distribuido em ambientes de agua doce. Devido a sua natureza cosmopolita e sensibilidade, o seu uso em estudos de ecotoxicidade, como biomarcador, e recomendado em protocolos nacionais e internacionais. Agentes poluentes como os agrotoxicos, efluentes industriais e metais sao diariamente despejados nos corpos d´agua, influenciando sistemas locais e podendo causar efeitos toxicologicos aos organismos aquaticos. Tendo em vista a necessidade da normalizacao de biomarcadores enzimaticos, nossa proposta foi analisar a atividade enzimatica de fosfatases de D. similis como uma alternativa.Especificamente, nossos objetivos foram: a) analisar o efeito de poluentes agricolas e metais nas atividades in vitro de fosfatases acidas e alcalinas de D. similis, com o intuito de selecionar a enzima mais sensivel a acao dos poluentes; b) realizar estudos mais detalhados in vitro com a fosfatase mais sensivel na presenca de poluentes preselecionados; c) avaliar a atividade in vivo desta enzima perante concentracoes subletais de poluentes provenientes de ensaios de toxicidade aguda. Dessa forma, foram analisados os efeitos in vitro de varios agentes poluentes (metais e pesticidas) nas atividades da fosfatase acida total (FAT) e fosfatase alcalina. A FAT apresentou maior alteracao em relacao a fosfatase alcalina quando exposta aos poluentes in vitro, sendo que, dentre estes, os metais apresentaram efeitos mais significativos. Dos metais testados, Al3+, Se3+ e Mo6+, exibiram maior efeito inibitorio, enquanto permetrina e Cd2+ apresentaram efeito ativador. A energia de ativacao da reacao catalisada pela FAT, usando-se p-nitrofenilfosfato (pNPP) como substrato, foi reduzida de 13 para 10 Kcal.mol-1 na presenca de 0,5mM de Cd2+. Na reacao catalisada pela FAT, os valores de IC50 (concentracao do metal que promove 50% de inibicao da atividade enzimatica) obtidos para Al3+, Se3+ e Mo6+, foram, respectivamente: 1,23 mM, 0,54 mM e 0,9 µM. A inibicao da FAT mostrou-se do tipo nao competitiva para oAl3+ e do tipo competitiva para Se3+ e Mo6+, com os seguintes valores de constante de inibicao (Ki): 0,9 mM para o Al3+; 0,62 mM para o Se3+ e 1,32 µM para o Mo6+. Nos ensaios in vivo de toxicidade aguda 48h com D. similis, a permetrina apresentou maior toxicidade comparada aos demais poluentes, sendo que a ordem de toxicidade, em mM, foi: Permetrina (0,000056) > Cd2+ (0,00139) > Se4+ (0,004) > Mo6+ (0,024) > Al3+(0,072). A ordem de inibicao da atividade da FAT de D. similis exposta ao EC50 (48h) assemelhouse a obtida nos ensaios de toxicidade aguda (Cd2+ > permetrina > Al3+ > Mo6+), sugerindo uma relacao entre alteracao de atividade enzimatica com a toxicidade dos poluentes ao modelo biologico em estudo. Nos ensaios de toxicidade aguda tambem foram estudados os efeitos da mistura binaria dos metais Al3+, Cd2+, Mo6+ e Se4+. Observou-se que somente Al3+ + Cd2+ (S = 0,588) e Al3+ + Mo6+ (S = 0,951) apresentaram efeito sinergico sobre D. similis, constatado pelo valor de S Al3+ + Mo6+ (78%) > Se4+ + Cd2+ (72%) > Mo6+ + Cd2+ (32%). Contraditoriamente, a mistura Se4+ + Mo6+ promoveu uma ativacao de 50% na atividade enzimatica nos mesmos niveis de toxicidade analisados para as demais misturas. Esses resultados evidenciam a necessidade de complementar os testes de toxicidade aguda com mistura de poluentes a partir da utilizacao de biomarcadores enzimaticos, tais como a FAT. Concluiu-se que a FAT, atraves da alteracao de sua atividade in vivo, pode ser utilizada como biomarcadora de toxicidade em nivel letal (EC50), para os poluentes permetrina e Al3+ e, em niveis subletais, para Cd2+ e Se4+, podendo-se prediz