Clinical and immunological heterogeneity of canine subepidermal blistering dermatoses with anti-laminin-332 (laminin-5) auto-antibodies

Laminin-332 (laminin-5) is a basement membrane heterotrimeric protein composed of alpha-3, beta-3 and gamma-2 laminin chains. Laminin-332 polypeptides are targeted by auto-antibodies in human patients with mucous membrane (cicatricial) pemphigoid or, more rarely, subepidermal vesicular diseases that resemble epidermolysis bullosa acquisita (EBA) or bullous pemphigoid (BP). The objectives of this report were to characterize the clinical, histopathological and immunological characteristics of nine dogs with auto-antibodies targeting laminin-332. Immunological investigations consisted of direct immunofluorescence (IF), indirect IF with intact and salt-split canine gingival, and salt-split normal or laminin-332-deficient human skin, immunoblotting with purified human laminin-332 and immunoblotting with recombinant NC1 domain of human collagen VII. All dogs exhibited varying degrees of skin blistering and ulceration associated with microscopic subepidermal vesiculation with or without inflammatory cells. Indirect IF established that circulating IgG auto-antibodies bound the dermal side of salt-split canine lip and human skin. In five dogs, IgG variably recognized the basement membrane of laminin-332-deficient human skin (three dogs negative, two dogs positive). In all nine dogs, IgG auto-antibodies detected purified human laminin-332 by immunoblotting. In two dogs, additional targeting of collagen VII-NC1 was present. These observations establish laminin-332 as a novel basement membrane antigen in dogs with autoimmune blistering diseases with variable clinical phenotypes. The names ‘acquired junctional epidermolysis bullosa’, ‘anti-laminin-332 mucous membrane pemphigoid (MMP)’ and ‘mixed auto-immune subepidermal blistering dermatosis’ are proposed for dogs with clinical signs reminiscent of EBA, MMP or BP respectively. Resume  La laminine-332 (laminine-5) est une proteine heterotrimerique de la membrane basale, composee des chaines de laminine alpha-3, beta-3 and gamma-2. Les polypeptides laminine-332 sont cibles par des auto-anticorps de patients humains atteints de pemphigoide de la membrane muqueuse (cicatricielle) ou, plus rarement, de maladies vesiculaires subepidermiques qui ressemblent a l’epidermolyse bulleuse acquise ou a la pemphigoide bulleuse. Les objectifs de cette etude etaient de determiner les caracteristiques cliniques, histopathologiques et immunologiques de neufs chiens ayant des auto-anticorps ciblant la laminine-332. Les investigations immunologiques consistaient une immuno-fluorescence directe (IF), indirecte sur de la muqueuse buccale canine intacte et clivee par NaCl, et de la peau humaine deficiente en laminine-332 ou normale clivee par le NaCl, en immunoblotting avec une peau humaine deficiente en laminine-332, et en immunoblotting avec un domaine NC1 recombinant de collagene VII humain. Tous les chiens ont montres des degres variables de clivage cutane et d’ulceration associes avec une vesiculation subepidermique microscopique avec ou sans cellules inflammatoires. L’IF indirecte a etabli que les auto-anticorps IgG circulant se lient au site dermique des levres canines et de la peau humaine clivees par le NaCl. Pour cinq chiens, les IgG ont variablement reconnus la deficience en laminine-332 de la membrane basale de peau humaine (3 chiens negatifs, 2 chiens positifs). Pour tous les neufs chiens, les auto-anticorps IgG ont detectes la laminine-332 purifiee humaine par immunoblotting. Chez deux chiens, une cible supplementaire du collagene VII-NC1 etait presente. Ces observations etablissent la laminie-332 comme un nouvel antigene de la membrane basale chez les chiens atteints de maladies auto-immunes de jonction avec des phenotypes cliniques variables. Les termes « epidermolyse bulleuse jonctionnelle acquise », « pemphigoide de la membrane muqueuse anti-lamainine-332 » et « dermatose de clivage subepidermique auto-immune mixte » sont proposes pour les chiens presentant des signes cliniques d’epidermolyse bulleuse acquise, de pemphigoide des membranes muqueuses ou de pemphigoide bulleuse respectivement. Resumen La laminina 332 (laminina 5) es una proteina de la membrana basal heterotrimerica compuesta de 3 cadenas alfa, 3 beta y tres gamma. Los polipeptidos de la lamina 332 son diana de autoanticuerpos en pacientes humanos con penfigoide de membranas mucosas (penfigoide cicatricial), o, mas raramente, enfermedades vesiculares que semejan epidermolisis bullosa adquirida o penfigoide bulloso. Los objetivos de este trabajo fueron investigar las caracteristicas clinicas, histopatologicas e inmunologicas de nueve perros con autoanticuerpos frente a laminina 332. Las investigaciones inmunologicas consistieron en inmunofluorescencia directa (IF), IF indirecta con tejido de labio canino separado por sal, y piel humana deficiente en laminina 332 separada por sal, inmuno-blotting con laminina 332 humana purificada e inmuno-blotting con el dominio NC1 del colageno VII humano. Todos los perros exhibieron varios grados de vesiculacion de la piel y ulceracion asociados con vesiculas subepidermales a nivel microscopico con o sin celulas inflamatorias. La IF indirecta establecio que autoanticuerpos IgG circulantes se unian al lado dermal del labio canino y la piel humana separados con sal. En cinco perros, la IgG reconocio de forma variable la membrana basal de la piel humana deficiente en laminina 332 (3 perros negativos, 2 perros positivos). En los nueve perros, autoanticuerpos IgG detectaron la laminina 332 humana purificada en el inmuno-blotting. En dos perros, tambien fue diana adicional el fragmento NC1 del colageno VII. Estas observaciones establecen la laminina 332 como un nuevo antigeno de la membrana basal implicado en perros con enfermedades vesiculares autoinmunes con variados fenotipos clinicos. Los nombres ‘epidermolisis bullosa adquirida de la union’, ‘penfigoide de membranas mucosas antilaminina 332′ y ‘dermatitis vesicular subepidermica autoimune mixta’ se proponen para perros con signos clinicos similares a epidermolisis bullosa adquirida, penfigoide de membranas mucosas y penfigoide bulloso, respectivamente. Zusammenfassung Laminin-332 (Laminin-5) ist ein heterotrimerisches Protein der Basalmembran, welches aus alpha-3, beta-3 und gamma-2 Laminin-Ketten besteht. Laminin-332 Polypeptide sind das Ziel von Autoantikorpern bei Menschen mit Schleimhaut Pemphigoid (Cicatrical Pemphigoid/Vernarbendes Pemphigoid) oder, seltener, bei subepidermalen vesikularen Erkrankungen, die der Epidermolysis bullosa aquisita oder dem bullosen Pemphigoid ahnlich sind. Die Ziele dieses Berichts bestanden darin, die klinischen, histopathologischen und immunologischen Charakteristika von neun Hunden mit Autoantikorpern, welche auf Laminin-332 gerichtet waren, zu beschreiben. Die immunologischen Untersuchungen bestanden aus direkter Immunfluoreszenz (IF), indirekter Immunfluoreszenz an intakter caniner Mundschleimhaut und an caniner Spalthaut (Salt-Split Methode), und an normaler humaner Spalthaut oder Laminin-332 defizienter Menschenhaut, Immunblott-Verfahren mit gereinigtem humanen Laminin-332 und mit der rekombinanten NC1 Domane des humanen Kollagen VII. Alle Hunde zeigten ein unterschiedliches Ausmas an Blasenbildung und Ulzerierung der Haut, die mikroskopisch durch subepidermaler Vesikelbildung mit oder ohne Entzundungszellen charakterisiert waren. Mittels indirekter IF wurden zirkulierende IgG Autoantikorper gezeigt, die an die dermale Seite der Spalthaut der caninen Lippe und der menschlichen Haut gebunden waren. Bei funf Hunden erkannten die IgG Antikorper die Basalmembran von Laminin-332 defizienter menschlicher Haut verschieden (3 Hunde positiv, 2 Hunde negativ). Bei allen neun Hunden erkannten die IgG Antikorper gereinigtes humanes Laminin-332 mittels Immunblott-Verfahren. Bei zwei Hunden war auch zusatzlich noch Collagen VII-NC1 betroffen. Diese Ergebnisse etablieren Laminin-332 als neues Antigen der Basalmembran bei Hunden mit autoimmunen blasenbildenden Krankheiten mit unterschiedlichen klinischen Phanotypen. Die Namen „Erworbene Junktionale Epidermolysis Bullosa“, „Anti-Laminin-332 Schleimhaut Pemphigoid“bzw. „gemischte auto-immune subepidermale blasenbildende Dermatose“werden fur Hunde mit klinischen Zeichen, die an eine Epidermolysis bullosa aquisita, an Schleimhaut Pemphigoid bzw. an bulloses Pemphigoid erinnern, vorgeschlagen.