Obtención y caracterización de células madre de pulpa dental humanas e interacción con β-fosfato tricálcico

OBJETIVOS Objetivo general: Obtener celulas madre de pulpa dental, optimizar el metodo de obtencion y de cultivo de estas celulas, y estudiar su interaccion con el biomaterial ?-fosfato tricalcico. Objetivos especificos: 1- Obtener celulas madre de pulpa dental. 2- Optimizar el metodo de obtencion de celulas madre de pulpa dental. 3- Caracterizar celulas madre de pulpa dental usando microscopia confocal. 4- Estudiar el crecimiento de celulas madre de pulpa dental a distintas presiones de O2 para optimizar su cultivo. 5- Estudiar la adhesion y el crecimiento de celulas madre de pulpa dental sobre el biomaterial ?-fosfato tricalcico. MATERIAL Y METODOS Se realizo un estudio prospectivo, in vitro, no controlado. Los dientes fueron extraidos por odontologos de la Unidad de Cirugia de la Clinica Odontologica de la Facultad de Medicina y Odontologia de la Universidad de Valencia, entre Mayo de 2008 y Marzo de 2012. Para obtener celulas madre de pulpa dental: 1- Se secciono la pulpa dental mecanicamente con una hoja de bisturi no10. 2- Se recogieron los fragmentos y se realizo la digestion de estos con 2 mg/mL de colagenasa tipo I durante 90 minutos (Metodo A) en condiciones de 37°C, 5% CO2 y 3% O2 Se centrifugo a 1000 g durante 2 minutos y se recogio el precipitado y cultivo en medio de cultivo completo a 37°C, 5% CO2 y 3% O2. En base a este protocolo se realizaron 8 protocolos mas con distintos agentes digestivos, disgregantes o combinandolos. Se estudio el rendimiento para la obtencion y el tiempo minimo necesario para obtener las celulas. Tambien se caracterizaron las celulas con marcadores de superficie, se cultivaron a distintas presiones de oxigeno y se realizazo una curva de crecimiento. Por ultimo, se estudio la ahesion y crecimiento de CMPD a ?- fosfato tricalcico. RESULTADOS Se obtuvieron CMPD con todos los metodos menos con la fragmentacion mecanica de la pulpa. Las celulas fueron positivas para los marcadores de superficie de celulas mesenquimales y negativos para los de celulas hematopoyeticas. Las CMPD proliferaron mas en condiciones tisulares de O2 (3%) que en condiciones ambientales (21%) y fueron capaces de proliferar sobre el biomaterial de regeneracion osea biomaterial ?-fosfato tricalcico. CONCLUSIONES 1- En nuestro grupo hemos obtenido celulas madre de pulpa dental, permitiendonos asi, determinar las condiciones optimas para su aislamiento y cultivo. 2- De todos los metodos empleados para su obtencion, la digestion de la pulpa con EDTA, colagenasa/dispasa, termolisina y sonicacion, fue el que demostro mayor velocidad de aislamiento de las celulas. 3- Las celulas obtenidas de la pulpa dental fueron positivas para los marcadores CD-133, Oct4, Nestin, Stro-1, demostrando sus caracteristicas de celulas madre mesenquimales. Ademas fueron negativas para el marcador de celulas madre hematopoyeticas CD-45. El marcador CD-34 fue positivo en un caso y negativo en otro. 4- Las celulas madre de pulpa dental mostraron una tasa de proliferacion mayor al ser cultivadas bajo condiciones fisiologicas de O2 (3%) que bajo condiciones ambientales (21% O2). 5- Las celulas madre de pulpa dental tienen la capacidad de adherirse y proliferar sobre el biomaterial de regeneracion osea ?-fosfato tricalcico