猪 Nhlh 2基因启动子活性及其表达调控的初步研究

旨在研究母猪 Nhlh 2基因启动子活性及其与转录因子之间的调控关系，为探索该基因的表达调控提供分子水平的依据，也为研究母猪繁殖机制提供一定的参考。本研究以猪卵巢组织DNA为模板，PCR扩增 Nhlh 2不同长度的启动子缺失片段，克隆到pGL3-basic载体构建启动子报告基因重组质粒，并将其转染到猪卵巢颗粒细胞，测定相对双荧光素酶活性值；通过染色质免疫共沉淀技术（ChIP），研究 Nhlh 2启动子与YY1、C/EBPβ蛋白之间的相互作用；随后构建转录因子超表达、突变载体和小干扰RNA（siRNA），利用双荧光素酶检测系统进行活性验证。经双荧光素酶报告系统检测发现， Nhlh 2基因的P7（-238~+129）区域启动子转录活性最高，-654~-238片段范围可能存在负调控元件，-238~-20区域可能存在正调控元件；通过生物信息学分析和ChIP验证， Nhlh 2启动子区-101~-85和-153~-140区域分别是转录因子YY1和C/EBPβ的结合位点；突变YY1和C/EBPβ的结合位点后，P7的双荧光活性显著上调；超表达YY1和C/EBPβ后，P7的双荧光活性显著下调；干扰YY1和C/EBPβ的表达后，P7的双荧光活性显著上调。本研究确定了猪 Nhlh 2基因的核心启动子区域为-238~+129，YY1和C/EBPβ分别结合在 Nhlh 2基因启动子区的-101~-85和-153~-140区域，抑制猪 Nhlh 2基因的转录活性。