Die Expression respiratorischer Proteine ausgewählter Arthropodenspezies

Hamoglobine und Hamocyanine erfullen in vielen Arthropoden eine Funktion im Transport und in der Speicherung von Sauerstoff. Hamoglobine gehoren zu der Klasse der Ham-Proteine, die sich alle durch den Besitz eines metallhaltigen Porphyrinkomplexes auszeichnen. Die reversible Bindung von Sauerstoff wird durch das zentral im Ham vorliegende, zweiwertige Eisenion ermoglicht. Im Gegensatz dazu binden Arthropoden-Hamocyanine mit Hilfe zweier Kupferionen Sauerstoff. Sie bilden stets Hexamere bzw. Multihexamere aus sechs ahnlichen oder identischen Untereinheiten, wobei jede dieser ca. 75 kDa Untereinheiten ein Kupferzentrum besitzt. Die Hamocyanine der Arthropoden werden mit vier hamocyanin-ahnlichen Proteinklassen bestehend aus Enzymen (Phenoloxidasen), Speicherproteinen (Pseudohamocyanine und Hexamerine) sowie bestimmten Rezeptoren (Hexamerinrezeptoren) zu der Hamocyanin-Superfamilie der Arthropoden zusammengefasst. In der vorliegenden Arbeit erfolgte die Identifizierung und Charakterisierung dieser zwei respiratorischen Proteine in ausgewahlten Krebstieren. Mit dem kiemenspezifischen Hamoglobin (CmaHb) der Strandkrabbe Carcinus maenas (Decapoda, Malacostraca) wurde erstmals ein intrazellulares Globin in den Crustacea nachgewiesen. CmaHb weist eine Membranlokalisation auf, die bislang nur im Falle einiger bakterieller Globine beschrieben wurde. CmaHb ist dabei das erste bekannte Globin, bei dem die Interaktion mit der Membran uber eine N-Myristoylierung vermittelt wird. Sequenzanalysen wiesen darauf hin, dass neben CmaHb auch Globinsequenzen der Chelicerata sowie zumindest zwei Globine der Insecta ein N-terminales Motiv fur eine N-Myristoylierung besitzen. Phylogenetische Analysen lassen vermuten, dass eine intrazellulare, membrangebundene Lokalisation die ursprungliche Form der Arthropoden-Globine darstellt. Aus diesen sind offensichtlich die intrazellularen, frei im Cytoplasma vorliegenden Globine der Insecta sowie die extrazellularen Globine der Insecta und Branchiopoda (Crustacea) hervorgegangen. Hypothesen zur Funktion des CmaHb umfassen den Schutz der Kiemenmembran vor ROS oder eine Rolle in einem noch unbekannten Signaltransduktionsprozess. Eine respiratorische Funktion ist dagegen aufgrund einer hohen Autoxidationsrate des CmaHb unwahrscheinlich. Ferner wurde am Versuchstier Speleonectes tulumensis (Remipedia) zum ersten Mal eindeutig die Expression eines respiratorischen, extrazellularen Hamocyanins auserhalb der Malacostraca belegt. Die drei Hamocyaninuntereinheiten gruppieren in allen phylogenetischen Analysen mit den Hamocyaninen der Insekten. Auffallig ist dabei, dass dieser Krebs beide Untereinheitstypen besitzt, die in Insekten vorkommen. Die erhaltenen Resultate weisen somit auf ein mogliches Schwestergruppenverhaltnis der Remipedia und Insecta sowie folglich auf eine Paraphylie der Crustacea hin. Jedoch sind weitere Analysen notwendig, um die Stellung der Remipedia sowie ihre Verwandtschaft zu den Hexapoda zu untersuchen. Im Rahmen eines dritten Projektes wurden erstmalig rekombinante Expressionssysteme fur ausgewahlte Mitglieder der Hamocyanin-Superfamilie der Arthropoden etabliert. Am Beispiel der Prophenoloxidase 3 (PPO3) aus D. melanogaster gelang es, einen kupferhaltigen Vertreter in biologisch aktiver Form in Insektenzellen zu exprimieren. Parallel durchgefuhrte Arbeiten mit heterologen, bakteriellen Expressionsystemen zeigten, dass sich auch diese prinzipiell fur die rekombinante Expression der Proteine dieser Superfamilie eignen. So gelang am Beispiel des Hexamerins LSP2 von D. melanogaster die Expression eines loslichen, kupferlosen Vertreters in E. coli. Nach Aufreinigung der rekombinanten LSP2-Untereinheiten konnte die Quartarstruktur des Proteins erfolgreich rekonstituiert werden. Bei der rekombinanten Expression der Kupferproteine in E. coli wurden ebenfalls gravierende Fortschritte erzielt, da erstmals die rekombinante Herstellung einer Phenoloxidase und eines Hamocyanins als losliches Apoprotein in Bakterien gelang. Mit der in dieser Arbeit erreichten rekombinanten Expression einer funktionellen Phenoloxidase und eines Hexamerins stehen somit bereits zwei Vertreter der Arthropoden-Hamocyanin-Superfamilie in ausreichender Menge zur Verfugung, die fur bioanalytische Studien eingesetzt werden konnen.