IN VITRO ELECTROPHYSIOLOGICAL STUDIES OF NEURONAL NETWORKS: A NOVEL DEVICE FOR RELIABLE, PROLONGED AND HIGH THROUGHPUT MICROELECTRODE ARRAY EXPERIMENTS

Lo scopo del presente lavoro di Dottorato e di avanzare i dispositivi tecnologici impiegati per indagini elettrofisiologiche in vitro di reti neuronali tramite matrici di microelettrodi (MEA). Le colture primarie di cellule neuronali accoppiate ai substrati MEA rappresentano oggi una metodologia essenziale per studiare le proprieta elettrofisiologiche di reti neuronali in condizioni fisiologiche e patologiche. Registrazioni non invasive e multi-sito dell'attivita elettrica neuronale tramite MEA sono sfruttate in molti studi riguardanti dinamiche neuronali di rete, plasticita neuronale e test farmacologici e tossicologici. Dato il ruolo atteso dei risultati da questi studi nell'ambito della ricerca in Neuroscienza, e fondamentale che gli esperimenti MEA producano risultati affidabili e riproducibili. A questo fine, un requisito cruciale e la presenza di condizioni ambientali fisiologiche durante l'acquisizione dell'attivita neuronale. Tuttavia, la rimozione ripetuta delle colture dall'incubatore per effettuare gli esperimenti MEA provoca una deviazione dei parametri ambientali (in termini di temperatura e composizione gassosa) dalle condizioni canoniche di coltura, nonche stress meccanico alle cellule e aumento del rischio di infezione. Affinche queste perturbazioni non inducano alterazioni funzionali e non diminuiscano la vitalita cellulare, la durata delle singole sessioni sperimentali e limitata a circa un'ora. Cio impedisce di tracciare senza interruzione processi neuronali che si sviluppano nell'arco di un periodo esteso (ad esempio, diverse ore o giorni), come la maturazione, la plasticita a lungo termine o effetti di trattamenti farmacologici cronici. Nonostante tentativi di miglioramento dei setup sperimentali MEA standard, ad oggi non esistono, ne in commercio ne a livello prototipale, soluzioni sperimentali per risolvere adeguatamente il problema suddetto. Per rispondere a questa esigenza, lo scopo di questo progetto di Dottorato e la realizzazione di una camera ambientale autonoma che assicuri condizioni fisiologiche stabili durante registrazioni MEA e migliori l'affidabilita dei dati e la comparabilita tra replicati sperimentali. La tesi descrive in dettaglio il progetto e la verifica del sistema, comprendendo verifiche di performance e la validazione biologica del dispositivo, costituito da: (a) una camera da banco per alloggiare colture neuronali su MEA; (b) sistemi per la riproduzione ed il monitoraggio di un ambiente fisiologico nella camera, senza richiedere l'intervento dell'operatore; (c) un'interfaccia elettronica per la lettura dei segnali MEA; (d) un software per analisi on-line dei segnali MEA, per ridurre il tempo richiesto per le analisi di dati ottenuti nel corso di esperimenti prolungati. E' stato possibile ottenere condizioni ambientali stabili ed uniformi nella camera, garantendo una vitalita cellulare paragonabile a quella di incubatori da laboratorio. L'attivita di colture cresciute nel dispositivo non ha presentato deviazioni funzionali, garantendo un monitoraggio dello stato intrinseco dei diverse colture in parallelo nel lungo termine (da poche ore a diversi giorni). Inoltre, il dispositivo ha permesso di ottenere dati riproducibili da esperimenti farmacologici dose-risposta. La piattaforma realizzata rappresenta dunque una soluzione efficiente per indagare fenomeni neuronali caratterizzati da dinamiche lente, come plasticita a lungo termine e meccanismi alla base di patologie neurodegenerative con tardo onset, quale ad esempio l'Alzheimer.