Caracterización de las subunidades de unión a nucleótido del transportador de nitrato/nitrito de la cianobacteria phormidium laminosum

En cianobacterias el nitrato/nitrito se transportan al inferior celular mediante un transportador "ATP-binding cassette" (ABC) denominado NRT, compuesto por cuatro subunidades proteicas: NrtA (subunidad periplasmica responsable de la union del nitrato/nitrito), NrtB (subunidad transmembranal), NrtC y NrtD (subunidades de union a nucleotido). En la cianobacteria filamentosa, termofila y no fijadora de nitrogeno, Phormidium laminosum se habian identificado los genes nrtA, nrtB y nrtC, que codifican el transportador ABC de nitrato/nitrito, formado parte del operon nir, junto con el gen mirA, que codifica la nitrito reductasa. En este trabajo se ha identificado el gen nrtD, a continuacion de mrtC, formando parte del operon nir. La subunidad NrtC del transportador de nitrato/nitrito de P.laminosum se ha purificado a partir de celulas deficientes en nitrogeno y se ha comprobado que hidroliza ATP in vitro, en ausencia del resto de componentes del transportador. Los genes nrtC y nrtD se han clonado en plasmidos de expresion pQE-9 y se han expresado en E.coli, purificandose como proteinas de fusion a cola de histidinas. Se han caracterizado las subunidades His6NrtC e His6NrtD por su capacidad para catalizar la hidrolisis de ATP, con respecto a su especificidad por varios sustratos y sensibilidad a inhibidores, demostrandose la que ambas proteinas hidrolizan ATP in vitro. Ademas, mediante elctroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones no desnaturalizantes se ha detectado la formacion de homodimeros de NrtC, His6NrtC e His6NrtD. La formacion de homodimeros de His6NrtD tambien se ha comprobado por espectrometria de masas MALDI-TOF.