Fonction d'une protéine membranaire : étude structurale et dynamique par RMN

L’utilisation de detergents est inevitable pour les etudes structurales des proteines membranaires. Dodecylphosphocholine (DPC) est un des detergents les plus utilises pour ce type d’etudes employant la spectroscopie de resonance magnetique nucleaire (RMN) en solution. L’effet des detergents sur la structure et la dynamique des macromolecules est une problematique importante, mais peu etudiee a ce jour. Dans cette etude nous avons caracterise la dynamique a l’echelle de la milliseconde, la liaison des substrats ainsi que des proprietes structurales de trois proteines membranaires differentes solubilisees dans des micelles de DPC. Ces proteines font partie de la famille des transporteurs mitochondriaux et nous avons choisi les sequences de la levure (ORC1, GGC1, AAC3). Nous avons detecte de la dynamique a l’echelle de la milliseconde qui est distribuee d’une maniere asymetrique a travers la structure. En contradiction avec des propos de la litterature, nous montrons que cette dynamique n’est pas correlee a la fonction, puisqu’elle n’est pas modifiee par des mutations qui inhibent le transport effectue par ces proteines quand elles sont reconstituees dans des liposomes. En plus, nous avons pu montrer que leur specificite par rapport aux substrats, n’est pas conservee quand ces transporteurs sont reconstitues dans du DPC, mettant en question leur fonctionnalite dans ce detergent. La RMN a aussi permis de demontrer que les structures tertiaire et secondaire sont perturbees dans les micelles avec quelques helices transmembranaires apparaissant exposees au solvant. Nous avons donc conclu que la presence du detergent a un effet fort sur les trois transporteurs mitochondriaux de notre etude et probablement d’autres proteines similaires, en les rendant tres flexible. Nos resultats indiquent un probable effet general de ce detergent sur les proteines membranaires, comme nous le discutons dans une analyse detaillee de quelques etudes de proteines membranaires decrites dans la litterature. Dans la seconde partie de ce travail, nous avons adresse une question fondamentale de la dynamique des proteines: comment se comportent les proteines dans des cristaux ? Nous avons etudie la dynamique de l’ubiquitine cristalline a l’echelle de la milliseconde afin de comprendre l’influence de la maille cristalline sur ce type de mouvement. Pour ce faire, nous avons employe la RMN a l’etat solide et des simulations de dynamique moleculaire de la proteine dans differents reseaux cristallins distincts. Il est interessant a noter que dans ces cristaux on detecte toujours des processus locaux d’echange dynamique sur une echelle de temps de la milliseconde. Cependant, en comparant les resultats obtenus avec differentes formes cristallines, nous constatons que les parametres thermodynamiques des differents etats en echange et les vitesses d’interconversion entre ces dernieres sont significativement modifies par les contacts cristallins. De plus, nous avons detecte des mouvements globaux de type «rocking» des ces molecules a l’etat cristallin qui surviennent egalement a l’echelle de la milliseconde. Ceci suggere que les mouvements globaux et locaux sont correles. Cette observation ouvre la discussion de l’importance de ce type de mouvements pour la qualite et l’interpretation des donnees des experiences de diffraction des rayons-X.