CRISPR/Cas9慢病毒系统敲除胰岛β细胞 PKA C - α 的研究

利用CRISPR/cas9系统建立稳定敲除PKA C-α基因的INS-1细胞株，研究PKA C-α在胰岛β细胞中的功能。设计2个长25 bp且分别靶向PKA C-α基因的exon 5和exon 7的sgRNA，将其克隆至LentiCRISPRv2-sgRNA质粒并转染至293T细胞中制备sgRNA-Cas9慢病毒，慢病毒感染INS-1细胞，嘌呤霉素筛选出阳性细胞并采用有限稀释法筛选单克隆细胞，Western blotting印记法检测单克隆细胞中PKA C-α蛋白的表达水平，测序确认单克隆细胞中PKA C-α基因的突变位点。WB实验证实靶向Exon 5的sgRNA可成功敲除PKA C-α基因，得到稳定敲除PKA C-α基因的细胞株，测序结果表明该细胞株的PKA C-α基因发生1 bp碱基插入突变，并且敲除PKA C-α基因的INS-1细胞胰岛素分泌能力下降。本实验利用CRISPR/Cas9系统成功敲除INS-1细胞中的PKA C-α基因，为研究PKA C-α在胰岛β细胞中的功能奠定了基础。