Charakterisierung der Interaktion von HTRA1 und Calpain 2

In der vorliegenden Dissertation wurde die Interaktion von HTRA1 und Calpain 2 charakterisiert und deren potentielle physiologische Rolle analysiert. Die Proteasen HTRA1 und Calpain 2 zeigen beide vielfaltige physiologische Funktionen. HTRA1 ist ein wichtiger Bestandteil der extrazellularen Proteinqualitatskontrolle, die Inhibierung von HTRA1 fuhrt beispielsweise zur Akkumulation des mit der Alzheimer’schen Krankheit (AD, alzheimer’s disease) assoziierten Aβ Peptids (Grau et al., 2005). Auch intrazellular ist HTRA1 in den Verlauf von AD involviert. HTRA1 ist dazu in der Lage das Mikrotubuli bindende Protein Tau und seine Aggregate zu proteolysieren (Tennstaedt et al., 2012). Intrazellulare Tau Fibrillen und extrazellulare Aβ Aggregate kennzeichnen AD (Crews & Masliah, 2010). Steigt die extrazellulare Aβ Konzentration kommt es durch Aktivierung von NMDA (N-Methyl-D-Aspartat) Rezeptoren zu einem Calcium Einstrom in das Cytosol der Zelle. Dadurch wird Calpain 2 aktiviert, kann Tau proteolysieren und die entstandenen Produkte zeigen ein erhohtes Potential zur Aggregation (Park & Ferreira, 2005). Auserdem aktiviert Calpain 2 verschiedene Kinasen, die durch Hyperphosphorylierung von Tau zur Aggregation von diesem und schlieslich zur Apoptose fuhren konnen (Vosler et al., 2008). Eine Aktivierung von HTRA1 ist also wunschenswert, die Aktivierung von Calpain 2 ist dagegen ein negativer Faktor in von AD. Mit Hilfe eines sogenannten C-Terminus Screens konnte Calpain 2 als ein potentieller Interaktionspartner von HTRA1 identifiziert werden. Der C-Terminus Screen wurde in Kooperation mit dem Institut fur medizinische Immunologie der Charite-Universitatsmedizin in Berlin durchgefuhrt und beinhaltete insgesamt 6223 Peptide, die den C-Termini des humanem Proteoms entsprechen. Fur die Untersuchung der moglichen Interaktion beider Proteasen wurde Calpain 2 im Verlauf dieser Dissertation kloniert und die Proteinreinigung etabliert. In einem Pulldown-Assay konnte die Bindung von Calpain 2 an HTRA1 nachgewiesen werden. Nach der Vorinkubation beider Proteasen konnte in einer Grosenausschlusschromatographie eine neue Proteinpopulation detektiert werden. Diese konnte bei Vorinkubation mit einer Mutante von HTRA1, der die PDZ-Domane fehlt, nicht beobachtet werden. Die PDZ-Domane von HTRA1 ist demnach essentiell fur die Bildung des HTRA1 – Calpain 2 Komplexes. Durch Vergleiche mit bekannten HTRA1 und Calpain 2 Mengen konnte eine Stochiometrie im Komplex von 1:1 abgeschatzt werden. Die molekulare Masse des Komplexes wurde mittels statischer Lichtstreuung nach Grosenausschlusschromatographie, MALS-SEC (multi-angle light scattering with size exclusion chromatography), genauer analysiert. Der HTRA1 – Calpain 2 Komplex besitzt eine molekulare Masse von 535 ± 0,5 kDa. Der Komplex besteht wahrscheinlich aus einem HTRA1 Trimer (109 kDa), was der stabilen oligomeren Form von HTRA1 entspricht, und vier Calpain 2 Heterodimeren (je 104 kDa). Damit ergibt sich fur den HTRA1 – Calpain 2 Komplex eine berechnete molekulare Masse von 525 kDa und eine Stochiometrie von 3:4 (1:1,3). Des Weiteren wurde die Struktur des Komplexes mittels Transmissionselektronenmikroskopie untersucht. Die Partikel, die im Transmissionselektronenmikroskop detektiert werden konnten, wiesen eine Grose von etwa 18 x 15 x 11 nm auf. Die Langen eines Modells aus Rontgenkristallstrukturen eines HTRA1 Trimers zusammen mit vier Calpain 2 Heterodimeren stimmt mit diesen experimentell bestimmten Langen gut uberein. Auserdem konnte festgestellt werden, dass der HTRA1 – Calpain 2 Komplex stabil ist, die Fraktionen des Komplexes der Grosenausschlusschromatographie wurden vereinigt und nochmals chromatographisch aufgetrennt. Hier konnte nur der Komplex, nicht jedoch die einzelnen Proteine, detektiert werden. Der HTRA1 – Calpain 2 Komplex dissoziiert demnach nicht in seine Einzelkomponenten. Mittels Immunfluoreszenzfarbungen von HTRA1 und Calpain 2 konnte ebenfalls eine mogliche Kolokalisation und damit wahrscheinlich eine Komplexbildung beider Proteasen in HeLa und SH-SY5Y Zelllinien in vivo gezeigt werden. Eine Vorinkubation von HTRA1 und Calpain 2 fuhrt zu einer deutlichen Aktivierung von HTRA1 nicht aber von Calpain 2. Es wurden pNA gekoppelte Peptide und das physiologisch relevante Substrat Tau sowie seine Fibrillen getestet. Massenspektrometrische Analysen der Proteolyseprodukte von Tau Fibrillen ergaben, dass der HTRA1 – Calpain 2 Komplex vor allem in der Repeat Regionen und der self assembly Region von Tau, die fur die Aggregation verantwortlich ist, vermehrte Schnittstellen im Vergleich zu den einzelnen Proteasen zeigte. Der HTRA1 – Calpain 2 Komplex konnte in der Bekampfung von AD eine Rolle spielen. Schon zu Fibrillen aggregiertes Tau konnte nach der Bildung des Komplexes schneller abgebaut und somit die Apoptose der Zelle verhindert werden.