Production et caractérisation d'un substitut dermique humain pour étudier la réponse de la matrice extracellulaire dans les phénomènes d'électroporation

L'electroporation est une methode physique utilisant le champ electrique pour permeabiliser transitoirement la membrane plasmique afin de faciliter l'entree de molecules d'interet therapeutique dans les tissus cibles. La principale application clinique est l'electrochimiotherapie (ECT), un traitement anticancereux local utilise pour traiter les tumeurs primaires et metastases. La seconde application est l'electrotransfert de gene (EGT), une methode pour introduire des acides nucleiques a l'interieur des cellules. Enfin, l'electroporation irreversible (IRE) est une methode utilisee pour tuer les cellules grâce a la permeabilisation permanente des membranes plasmiques. Meme si les mecanismes in vitro sont de mieux en mieux compris, l'efficacite in vivo est variable selon le tissu cible. En effet, bien que l'electrotransfert d'ADN soit tres efficace in vitro sur des cultures en deux dimensions (2D), il est souvent beaucoup moins efficace in vivo, ce qui limite ses applications cliniques. L'organisation du tissu in vivo est plus complexe que la culture cellulaire in vitro car les cellules developpent des jonctions intercellulaires et une matrice extracellulaire (MEC). Des etudes in vivo ont demontre que la composition de la MEC module la biodistribution de l'ADN dans le tissu et donc l'efficacite de l'electrotransfert de gene. La reponse de la MEC a l'application de champ electrique dans ce processus reste encore a definir afin d'ameliorer l'efficacite de cette methode. Les modeles classiques en 2D ne possedent pas cette organisation architecturale tridimensionnelle (3D) leur permettant d'etre physiologiquement comparable au tissu natif. Afin d'etudier les mecanismes d'electrotransfert d'ADN a l'echelle des tissus, nous avons utilise un modele de peau humaine 3D pour imiter et predire les situations in vivo. Les objectifs de ce travail etaient d'etudier le role et la reponse de la MEC cutanee lors de l'electrotransfert de gene a l'echelle du tissu. La premiere partie de ce projet a ete de caracteriser la MEC du substitut dermique reconstruit par ingenierie tissulaire. La MEC a ete caracterisee par microscopie electronique, coloration histologique et generation de seconde harmonique (SHG). Pour evaluer si ce modele imite efficacement la reponse in vivo observee lors de l'electroporation, une gamme de voltage utilisant des parametres electriques ECT ou EGT a ete appliquee et la permeabilisation cellulaire ainsi que l'expression du plasmide ont ete analysees sur tissu frais. Dans la deuxieme partie, nous avons etudie les effets directs et indirects du champ electrique pulse sur les collagenes fibrillaires. Les parametres de champs electriques ECT, EGT et IRE ont ete appliques directement sous le microscope a deux photons afin de visualiser les modifications de la SHG en direct. En conclusion, des substituts dermiques humains riches en MEC endogene ont ete produits selon l'approche d'auto-assemblage. Notre etude montre que les cellules de ce modele 3D sont efficacement electropermeabilisees. Un gene rapporteur a ete electrotransfere avec succes dans ce modele 3D et les cellules transfectees se trouvaient uniquement a la surface du tissu, en contact avec la solution d'ADN plasmidique. En outre, nous avons montre que le succes de l'electrotransfection depend de la mobilite des plasmides dans les tissus riches en collagenes. L'ingenierie tissulaire produit un outil biologique valide pour l'etude in vitro des mecanismes d'electrotransfert de gene dans la peau humaine. Enfin, nous avons observe que les parametres electriques classiquement utilises en ECT et EGT ne modifient pas l'organisation des collagenes fibrillaires a la fois dans des tissus vivants et decellularises, contrairement a ceux utilises en IRE qui diminuent de maniere significative et stable l'intensite de SHG dans les tissus frais, tres probablement a cause d'une importante liberation de metalloproteinases (MMPs) actives. Les collagenes fibrillaires sont donc affectes indirectement par l'application d'impulsions electriques IRE.