Auswirkungen von Staphylococcus aureus auf die Endothelpermeabilität in Ea.hy926-Zellen

Staphylococcus aureus (S. aureus) ist einer der haufigsten Erreger schwerer endovaskularer Infektionen, die haufig mit einer Dissemination des Erregers in andere Organe und lebensbedrohlichen Komplikationen wie Endokarditis, Osteomyelitis oder Abszessen assoziiert sind. Entscheidender Schritt in der Pathogenese endovaskularer Infektionen ist die Schadigung und Uberwindung der Endothelbarriere. Fur deren Integritat ist die Intaktheit von Zell-Zell-Verbindungen elementar, diese werden unter anderem durch Src-Kinasen reguliert. Es ist bekannt, dass S. aureus Fibronektin-Bindeproteine (FnBPs) masgeblich fur die Adharenz und Invasion des Erregers in Endothelzellen sind. Die Invasion erfolgt uber eine indirekte Bindung an α5β1-Integrine, invasive Eigenschaften finden sich in nahezu allen klinischen Isolaten. In verschiedenen Tiermodellen konnte auserdem ein Zusammenhang zwischen der Expression von FnBPs und der Dissemination von S. aureus in andere Organe gezeigt werden. Bislang ist jedoch nicht untersucht, welche Auswirkung die S. aureus-Infektion auf die Endothelbarriere hat und welche Mechanismen fur die Translokation des Erregers verantwortlich sind. In dieser Arbeit wurde analysiert, ob die Infektion mit S. aureus- und S. carnosus-Stammen in vitro zu einer Schadigung der endothelialen Integritat von EA.hy926-Zellen fuhrt. Hierzu wurden Anderungen der transendothelialen Impedanz und der Endothelpermeabeabilitat nach Infektion im xCELLigence- bzw. Transwell-System erfasst. Zytotoxische Effekte wurden durch Kristallviolettfarbungen, immunfluoreszenz-mikroskopische Untersuchungen der Mitochondrien und Nuklei sowie die Erfassung der hypodiploiden Zellkerne mittels Durchflusszytometrie quantifiziert. Zur Entschlusselung des molekularen Mechanismus wurden Veranderungen der Adherens und Tight Junction-Proteine ZO-1 und VE-Cadherin in der Immunfluoreszenz untersucht. Die Rolle von Src-Kinasen wurde durch pharmakologische Inhibition analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass FnBP-exprimierende S. aureus-Stamme eine Abnahme der transendothelialen Impedanz verursachen und dass es 4 und 24 Stunden nach Infektion zu einer signifikanten Zunahme der Endothelpermeabilitat kommt. Zytotoxische Effekte auf die Endothelzellen durch die Infektion traten nach 24 Stunden auf, jedoch nicht nach 4 Stunden. VE-Cadherin und ZO-1 zeigten 4 Stunden nach Infektion eine FnBP-abhangige Konformationsanderung und Reduktion der Signalintensitat. Auserdem konnte demonstriert werden, dass die Inhibition von Src-Kinasen den Anstieg der Endothelpermeabilitat signifikant reduziert. In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal belegt, dass S. aureus FnBPs eine Erhohung der Endothelpermeabilitat bewirken. Wahrend hierfur zu spaten Zeitpunkten Apoptose verantwortlich ist, muss nach 4 Stunden ein anderer Mechanismus ursachlich sein. Da es zu einer Abschwachung der ZO-1- und VE-Cadherin-Signalintensitat in der Immunfluoreszenz kam, ist anzunehmen, dass Adherens und Tight Junctions durch die Infektion geschadigt werden. Es ist bekannt, dass Src-Kinasen durch die Infektion mit S. aureus aktiviert werden. Auserdem sind sie elementar fur die Regulation der Endothelpermeabilitat und vermitteln diesen Effekt unter anderem uber eine Phosphorylierung von Adherens und Tight Junction-Proteinen. Eine Src-vermittelte Phosphorylierung von Zell-Zell-Verbindungsproteinen ware daher eine mogliche Erklarung fur die beobachteten Veranderungen von ZO-1 und VE-Cadherin. Dieser Mechanismus konnte Wegbereiter fur die parazellulare Passage uber die Endothelbarriere sein. Daruber hinaus konnte die erhohte Endothelpermeabilitat den Zugang zur Extrazellularematrix und zum grosten Pool an Fibronektin und Integrinen ermoglichen und so die Invasion und Transzytose begunstigen. Die hier gewonnenen Ergebnisse tragen dazu bei, die komplexe Interaktion zwischen S. aureus und dem Endothel und somit wichtige Schritte in der Pathogenese endovaskularer Infektionen besser zu verstehen und neue Zielstrukturen fur therapeutische Interventionen zu identifizieren.