结核病DNA疫苗pVAX1/ESAT-6的构建、鉴定及免疫效应评价

目的 构建结核病DNA疫苗pVAX1/ESAT-6并探讨其诱导的免疫效应。方法 将扩增自结核杆菌基因组的ESAT-6基因装入pVAX1载体构建pVAX1/ESAT-6重组质粒；经酶切、测序鉴定后，利用阳离子聚合物介导将重组质粒pVAX1/ESAT-6转染Hela细胞，分别以RT-PCR法检测ESAT-6 mRNA的表达、间接免疫荧光法检测ESAT-6蛋白表达。重组质粒经体内电转染免疫小鼠后，采用ELISA法测定小鼠血清中IFN-γ及抗ESAT-6特异性抗体IgG的水平；流式细胞术检测小鼠淋巴细胞增殖水平；ELISPOT检测产生IFN-γ的淋巴细胞频数。结果 构建的重组质粒pVAX1/ESAT-6经双酶切于3000 bp和300 bp处各见1条带，测序结果显示插入序列与ESAT-6基因序列无差异。重组质粒转染Hela细胞后，RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳于约300 bp处见目的条带，间接免疫荧光检测显示特异性绿色荧光。重组质粒免疫小鼠后，血清中抗ESAT-6特异性抗体IgG水平较对照组（空质粒组和生理盐水对照组）明显升高；血清中IFN-γ水平、小鼠脾淋巴细胞增殖水平及产生IFN-γ的淋巴细胞数明显均高于对照组（空质粒组和生理盐水对照组）。结论 成功构建了结核病DNA疫苗pVAX1/ESAT-6，该疫苗可有效诱导小鼠产生特异性细胞免疫和体液免疫效应。