Tipificación del fenotipo inflamatorio en el asma bronquial en niños de 7 a 14 años, mediante recuento celular y determinación de citoquinas en esputo inducido

Introduccion: La induccion de esputo es una tecnica escasamente invasora para el estudio y la monitorizacion de la inflamacion de la via aerea. Objetivos: El objetivo principal del estudio fue comparar el perfil celular y los niveles de citoquinas Th1 y Th2 en esputo inducido entre ninos asmaticos atopicos, asmaticos no atopicos y sanos. Metodos: La induccion de esputo fue realizada mediante inhalacion de suero salino hipertonico a concentraciones crecientes (3%, 4% y 5%). Se determino la fraccion exhalada de oxido nitrico en los pacientes asmaticos y se midio la FEV1 al inicio y despues de cada periodo de inhalacion para garantizar la seguridad de los ninos. El procesado del esputo se hizo siguiendo el metodo de Pizzichini y cols. Se separo el esputo de la saliva y se anadio un volumen de solucion de ditiotreitol igual a 4 veces el peso del esputo. Se agito la mezcla y despues de colocarla en banco mecedor durante 10 minutos se anadieron 4 volumenes de PBS de Dulbecco. La suspension resultante se filtro a traves de una gasa de nylon de 48 micras, centrifugandose a continuacion durante 10 minutos a 2.500 rpm para obtener un pellet (sedimento) celular donde se determinaron el recuento celular total y la viabilidad celular y un sobrenadante que se guardo a -80oC para la determinacion de citoquinas. Se considero una buena muestra si la viabilidad celular era > 60% y la contaminacion por celulas escamosas < 20%. Mediante citocentrifuga se obtuvieron las preparaciones y tras tincion de May-Grunwald-Giemsa se realizo el recuento celular diferencial con microscopio optico. Los niveles de IFN-gamma, IL-2, IL-10, IL-8, IL-6, IL-4, IL-5, IL-1beta, TNF-alfa, e IL-12p70 en el sobrenadante se determinaron mediante citometria de flujo (Bender Medsystem, USA). El analisis estadistico se realizo con el programa SPSS15.0. Se aplicaron los siguientes tests parametricos o no parametricos segun los grupos seguian o no una distribucion normal (prueba de normalidad de Kolmogorow-Smirnov), y segun fuera apropiado: t de Student para datos no apareados, analisis de la varianza de una via, test no parametricos de la U de Mann-Witney, y de Kruskal-Wallis, Chi-cuadrado, prueba exacta de Fisher y correlacion lineal de Pearson. Se consideraron significativos valores de p < 0,05. Los resultados se expresaron como media y desviacion estandar (DE) o mediana y rango intercuartilico. Resultados: Se realizo induccion de esputo a 77 ninos asmaticos (52 varones) y a 31 sanos (17 varones) de 7 a 15 anos. Entre los asmaticos, 51 no recibian tratamiento y 26 recibian corticoides inhalados. Diecisiete pacientes presentaban un asma no atopica y 60 asma atopica. Se obtuvieron 64 muestras en los asmaticos (83,1% de las inducciones) y 24 muestras en los ninos sanos (77,4%) de las que 49 y 18 adecuadas respectivamente. La mediana de eosinofilos en esputo inducido de los asmaticos atopicos (1,5%) fue mayor que en los no atopicos (0%) (p=0,02) y que en los ninos sanos (0%) (p=0,003). Las citoquinas Th2 (IL-4 e IL-5) y Th1 (IFNgamma, IL-2 e IL-12p70) fueron superiores en los asmaticos atopicos que en los sanos y en los asmaticos no atopicos (p<0,0001). La IL-8 fue mayor en los ninos asmaticos (atopicos y no atopicos) que en los controles (p<0,0001). La IL-10 fue mayor en los controles que en los asmaticos atopicos (p=0,03). No existieron diferencias en el resto de citoquinas (IL-6, IL-1beta y TNF-alfa). Conclusiones: El perfil inflamatorio de los ninos asmaticos muestra un aumento en las citoquinas proinflamatorias en el esputo inducido respecto a los ninos sanos. Existen diferencias en el perfil de citoquinas en esputo inducido entre los ninos asmaticos atopicos y no atopicos.