Cytochrom-P450-Biokatalyse: Selektive Oxidation von 14-gliedrigen Makrozyklen und Diterpenoiden
2016
Cembranoide bilden eine diverse Naturstoffklasse der Diterpenoide, deren Vertreter hauptsachlich aus marinen Invertebraten und Pflanzen isoliert wurden. Sie weisen unterschiedliche biologische Aktivitaten auf, die u.a. fur pharmazeutische Anwendungen interessant sind. Strukturell bestehen Cembranoide aus einem 14-gliedrigen zyklischen Kohlenwasserstoffgerust und zusatzlichen Sauerstoff enthaltenden Gruppen. In der Biosynthese von Cembranoiden wird zunachst ein terpenoides Gerust erstellt, in das anschliesend mit Hilfe von Cytochrom-P450-Monooxygenasen Sauerstoff¬funktionalitaten eingefuhrt werden. Auch in der organischen Synthese sind Oxyfunktionalisierungen in spaten Synthesestufen als ein effizientes Konzept beschrieben worden, um hohe Diversitaten chemischer Verbindung zu generieren. Die Herausforderung dieser spaten Funktionalisierung stellt dabei die geforderte hohe Chemo-, Regio- und Stereoselektivitat dar. In der vorliegenden Arbeit sollte das biokatalytische Potential der Cytochrom-P450-Monooxygenase P450-BM3 (CYP102A1) aus Bacillus megaterium fur die spate Oxyfunktionalisierung verschiedener Cembranoide und Cembranoid-ahnlicher Substrate untersucht werden. Um den Effekt der Struktur des Substrates auf die enzymatische Aktivitat und Selektivitat zu untersuchen, wurde eine Reihe aus neun verschiedenen 14-gliedrigen Makrozyklen hinsichtlich einer P450-BM3-katalysierten Oxidation getestet. Es wurden sowohl synthetische Verbindungen als auch Naturstoffe analysiert, die jeweils eine unterschiedliche Polaritat und eine unterschiedliche Anzahl an Doppelbindungen aufweisen. Unter Verwendung der P450-BM3-Mutante F87G konnte mit allen Makrozyklen eine Oxidation nachgewiesen werden. Je nach Substrat wurden funf bis uber sechzehn verschiedene Produkte detektiert, die jeweils ein bis vier neu eingefuhrte Sauerstoffatome besasen. Von zwei der untersuchten Makrozyklen konnte in weiterfuhrenden Studien die Chemo-, Regio- und Stereoselektivitat der Reaktion uber semirationales Proteindesign verbessert und die Anzahl der Produkte auf ein bis drei reduziert werden. Nach Oxidationen im praparativen Masstab konnten die Produkte in isolierten Ausbeuten von bis zu 57 % erhalten werden und deren Strukturen mittels NMR-Spektroskopie aufgeklart werden.
Um eine chemo- und regioselektive Oxidation cembranoider oder Cembranoid-ahnlicher Verbindungen zu erreichen wurde eine Kollektion aus P450-BM3-Varianten generiert, die Aminosauresubstitutionen an verschiedenen Positionen nahe des katalytischen Hamzentrums enthielten. Die P450-BM3-Varianten wurden hinsichtlich einer selektiven Oxidation des 14 gliedrigen Makrozyklus (3E,7E,11E)-9-Hydroxy-4,8-dimethylcyclotetradeca-3,7,11-trien-1,1-dimethansauredimethylester und des Cembranoids β-Cembrendiol getestet. Beide Makrozyklen enthalten als kaum funktionalisierte diterpenoide Geruste zahlreiche chemisch aquivalente Oxidations¬positionen. Fur (3E,7E,11E)-9-Hydroxy-4,8-dimethylcyclotetradeca-3,7,11-trien-1,1-dimethansauredimethylester konnte die P450-BM3-Mutante V78G/F87A identifiziert werden, die unter dreizehn moglichen Oxidationspositionen das Diterpenoid an der Position C-5 mit einer Chemo- und Regioselektivitat von 90 % hydroxylierte. Fur β-Cembrendiol, das neben drei potentiellen Epoxidierungs¬positionen sieben potentielle allylische und sechs nicht-allylische Hydroxylierungspositionen besitzt, wurden P450-BM3-Mutanten zur selektiven Hydroxylierung der benachbarten allylischen Positionen C-9 und C-10 oder zur Epoxidierung der C-7/C-8-Doppelbindung gefunden. Die P450-BM3-Mutante F87A/I263L wies eine 100 %ige Regioselektivitat fur C 9 auf und produzierte die epimeren 9-OH-β-Cembrentriole in einem Diastereomeren¬verhaltnis von 89:11. Eine 97 %ige Regioselektivitat fur C-10 konnte mit der P450-BM3-Mutante L75A/V78A/F87G erzielt werden, die die epimeren 10-OH-β-Cembrentriole sowie das korrespondierende Enon herstellte. Die 10-OH-β-Cembrentriole wurden bestenfalls in einem Diastereomerenverhaltnis von 74:26 gebildet. Mit der P450-BM3-Mutante V78A/F87A konnte das (7S,8S)-Epoxy-β-cembrendiol mit exzellenter Diastereoselektivitat (dr > 99:1) produziert werden.
Weiterhin konnte eine sequentielle P450-P450-Kaskadenreaktion fur die zweifache Hydroxylierung des β Cembrendiols an den Positionen C-9 und C-10 als Eintopfprozess etabliert werden. Um einen geeigneten Biokatalysator fur den zweiten Schritt zu finden, wurde eine Kollektion an P450-BM3-Mutanten durchmustert. Dabei konnten Mutanten identifiziert werden, die das 9 OH-β Cembrentriol an Position C-10 hydroxylieren. Wahrend die P450-BM3-Mutante V78A/F87G die 9,10-OH-β-Cembrentetraole in einem Diastereomerenverhaltnis von 50:50 herstellte, konnte mit der Dreifachmutante L75A/V78A/F87G das Diastereomerenverhaltnis optimiert werden (11:89).
Keywords:
- Correction
- Source
- Cite
- Save
- Machine Reading By IdeaReader
0
References
0
Citations
NaN
KQI