Estudio preliminar de la expresión del mensaje genético del transportador de serotonina en células mononucleares de sangre periférica en pacientes con dependencia al alcohol con y sin depresión mayor comórbida

La Encuesta Nacional de Adicciones 2008 reporto que en Mexico existen 39 millones de personas que consumen alcohol y 4.8 millones presentan dependencia. A nivel mundial varios estudios indican que los pacientes con dependencia al alcohol (40 a 50%) presentan comorbilidad con algun tipo de padecimiento psiquiatrico. La funcion serotoninergica es un mediador clave en los estados de animo, la impulsividad y las conductas adictivas, entre ellas el consumo de alcohol. Se ha reportado que el consumo excesivo de alcohol etilico disminuye los niveles de serotonina, aumenta la frecuencia de disparo de las neuronas serotoninergicas en el nucleo del rafe y aumenta los niveles de serotonina en el nucleo accumbens. Las tecnicas de biologia molecular han permitido identificar factores de riesgo genetico y se han seleccionado genes candidatos del sistema serotoninergico, siendo uno de ellos el gen para el transportador de serotonina (5-HTT), el cual se ha demostrado que se encuentra asociado tanto a una mayor susceptibilidad para el establecimiento de la dependencia al alcohol como a la depresion mayor. Los receptores del sistema serotoninergico como el 5-HTT, el 5-HT1 y el 5-HT2 se expresan tanto en las celulas del Sistema Nervioso como en las celulas del sistema inmunologico, lo que sugiere una similitud funcional de ambos sistemas. Es por ello que las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) han sido utilizadas como un modelo de estudio en los trastornos de dependencia al alcohol y en los psiquiatricos. El objetivo de este estudio fue evaluar los niveles de expresion del gen 5-HTT en celulas mononucleares de sangre periferica de pacientes con dependencia al alcohol con y sin depresion mayor comorbida. En el Servicio de Consulta Externa del Centro de Ayuda a Alcoholicos y Familiares (CAAF) y en el Centro de Alcoholicos y Drogadictos «Carrasco» se evaluaron 70 pacientes durante el periodo comprendido entre febrero y noviembre de 2008. De entre estos se incluyeron 24 que cumplieron con los criterios diagnosticos para la dependencia al alcohol de acuerdo al DSM-IV por medio de la entrevista estructurada Mini International Neuropsychiatric Interview (MINI) en su version en espanol. Cumplieron ademas con los siguientes criterios de inclusion: a) Que fueran pacientes de nuevo ingreso, b) Mayores de 18 anos, c) De sexo femenino o masculino, d) Libres de tratamiento farmacologico tres semanas antes de incluirlos al estudio y e) Firmar carta de consentimiento informado para participar en el estudio. Se incluyeron para comparacion voluntarios sanos (n=12) los cuales fueron seleccionados de la poblacion abierta de la Ciudad de Mexico en el periodo de febrero a noviembre de 2008 y que cumplieran con los siguientes criterios: a) No tener algun diagnostico psiquiatrico, para lo cual se aplico el MINI, b) Mayores de 18 anos, c) Sexo femenino o masculino, d) Libres de tratamiento farmacologico tres semanas antes de incluirlos en el estudio y e) Firmar carta de consentimiento informado para participar en el estudio. Todos los participantes asistieron de 8:00 hs. a 9:00 hs. al laboratorio clinico del Instituto Nacional de Psiquiatria Ramon de la Fuente para la obtencion de la muestra de sangre periferica de la cual se obtuvieron las PBMC. Se realizo la extraccion del material genetico (RNA) de las muestras de PBMC con el reactivo de Trizol®. Aislamiento del RNA y RT-PCR Las muestras de RNA fueron tratadas con DNasa 1 (Invitrogen Life Technologies; CA, USA) para eliminar la contaminacion con DNA. La sintesis de cDNA (DNA copia) fue equivalente para todos los casos y se realizo a partir de 1 �Eg de RNA total en un volumen de reaccion de 20�EL que contenia 5�EL de Buffer 5x para Retro-Transcriptasa (Promega; WI, USA), 15 mM de MgCl2, 1.25 �El 10 mM de la mezcla dNTP (Promega; WI, USA), 200 U M-MLV transcriptasa reversa (Promega; WI, USA) y 1 �EL de 10 mM OligodT (GE, UK). La mezcla de reaccion se incubo durante 60 minutos a 42oC en un termociclador (Gradient Thermocycler; Eppendorf, Germany) y se aplico un ciclo final de 90oC por cinco minutos. La amplificacion para el 5-HTT se realizo en un volumen final de reaccion de 25 �EL que contenia 2 �EL de cDNA, 1 mM de desoxiribonucleotidos Mix dNTP (Promega; WI, USA), 0.75 mM de MgCl2, 2.5 mM de oligonucleotidos y 1.25 unidades de GoTaq DNA Polimerasa (Promega; WI, USA) con una fase de desnaturalizacion de 94��C/1 minuto, una fase de alineacion de 60��C/1 minuto y una fase de extension de 72��C/1.30 minutos, durante 35 ciclos. Los oligonucleotidos utilizados para el 5-HTT fueron los siguientes: sentido (5�L-GAACTCCTGGAACACTGGCAAC-3�L) y el antisentido (5�L- ATGACAAATCCCGAAACGAAGC-3�f) con un peso de 534 pares de bases (pb). En el caso del GAPDH las secuencias de oligonucleotidos utilizadas fueron: sentido (5�L-TGGGGAAGGTGAAGG TCGGAGTC-3�L) y antisentido (5�L-GACTTCAACAGCGACACCCACTC-3´) con un peso de 874 pb. Los productos de amplificacion se separaron en geles de agarosa al 2% y se tineron con bromuro de etidio. El analisis se realizo por densitometria computarizada (QuantityOne, Bio-Rad 2008). Los voluntarios sanos presentaron una mayor expresion del gen (0.5012±0.1349) comparados con los pacientes con dependencia al alcohol (0.3150±0.1836), esta diferencia fue significativa (p<0.0036, Mann-Whitney). Los niveles de expresion del gen 5-HTT para los pacientes con dependencia al alcohol con depresion mayor comorbida fueron significativamente reducidos (no detectables). Con la tecnica del PCR se determino que la expresion del gen 5-HTT esta disminuida en los dos grupos de pacientes comparados con los voluntarios sanos. Estos resultados coinciden con los estudios que han reportado que la expresion del gen 5-HTT en linfocitos de pacientes con trastorno depresivo mayor es menor comparada con los sujetos sanos. La no deteccion del mensaje genetico del 5-HTT en los pacientes dependientes al alcohol con depresion mayor comorbida sugiere que la comorbilidad puede potenciar la reduccion en la expresion del 5-HTT.