TβR-II-RANTES融合基因重组腺病毒的抗肿瘤作用

目的 构建表达融合基因TGF-βⅡ型受体（TβR—Ⅱ）胞外区及活化T细胞表达和分泌的调节因子（RANTES）重组腺病毒载体，并观察其抗肿瘤作用。方法 RT—PCR扩增小鼠TβR—Ⅱ胞外区和RANTES基因，重叠PCR扩增融合基因TβR-Ⅱ胞外区·RANTES。采用adMax adenovirus vectorcreation试剂盒构建表达融合基因重组腺病毒。体外感染小鼠肺腺癌LA795细胞系，绘制细胞生长曲线。采用Westernblot法检测感染后细胞融合基因的表达；酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测其培养上清的蛋白含量；Annexin V—FITC法检测感染后细胞的凋亡；并观察感染后细胞培养上清对小鼠脾细胞的趋化作用。将感染后的细胞（1×10^5个）接种于T739小鼠，观察成瘤时间和生存时间；1×10^10pfu的重组腺病毒局部注射荷瘤小鼠，观察肿瘤的大小变化，并统计肿瘤的重量和计算抑瘤率。结果经测序证实，RT—PCR正确扩增小鼠TβR—Ⅱ胞外区和RANTES基因，重叠PCR正确扩增融合基因TβR-Ⅱ胞外区．RANTES。重组质粒pDC316-融合基因经酶切鉴定正确，与pJM17双质粒共转染获得表达融合基因重组腺病毒，病毒滴度为8×10^10pfu／ml。Westernblot结果表明，感染后的LA795细胞有融合蛋白的特异性条带出现；培养上清中，游离TGF—β1的水平显著减低，而RANTES的水平显著升高。感染融合基因重组腺病毒的细胞生长速度明显减低，凋亡率为16．9％；培养上清可趋化小鼠脾细胞，与对照组之间差异均有统计学意义。感染融合基因重组腺病毒组与对照组相比，体内成瘤时间和生存时间明显延长；局部注射融合基因重组腺病毒可显著抑制肿瘤的生长，抑瘤率为37．6％。结论成功构建表达融合基因TβR-Ⅱ胞外区-RANTES重组腺病毒可有效结合TGF—β1，显著逆转TGF-β介导的免疫抑制状态，高水平表达RANTES强化肿瘤局部的免疫功能，具有显著的�