敲除 L - periaxin 基因的大鼠RSC96细胞系的建立

轴周蛋白(Periaxin)是外周神经系统非致密性髓鞘中特异表达的蛋白，编码Periaxin的基因经由选择性剪接产生两种蛋白异构体L-periaxin和S-periaxin，对髓鞘形成的初始化有重要作用。至今在 Periaxin 基因上已发现有18种不同的位点突变导致外周脱髓鞘神经疾病腓骨肌萎缩症4F亚型(CMT4F)的发生。利用转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)靶向基因敲除技术对大鼠RSC96细胞的 periaxin 基因进行敲除，根据TALENs设计原则，确定 L-periaxin 基因的敲除靶点在其编码NLS结构域部分，设计相应的TALEN左臂与右臂的识别序列，构建含上述识别序列的 L-periaxin 基因敲除载体TALEN-L和TALEN-R，并将其转入RSC96细胞，经嘌呤霉素药物筛选，获得 L-periaxin 基因敲除细胞株，经测序确认大鼠RSC96细胞中的基因组中 L - periaxin 基因区段已被敲除，成功构建了 L-periaxin 基因敲除细胞模型。计算 L-periaxin 基因敲除载体的突变率为21.6%。Western blotting实验证明，在RSC96细胞中只能检测到S-periaxin蛋白的表达。通过流式细胞术及MTT实验检测基因敲除细胞的细胞周期和生长速度，发现敲除 L-periaxin 基因的细胞生长速度缓慢，G1期细胞增多，S期细胞减少。