Aufnahme von Albumin-Konjugaten in humane Tumor-Zelllinien

Die Entwicklung Nanomedizin-basierter Therapeutika (Nanomedizin = medizinsche Anwendung der Nanotechnologie) hat zum Ziel, pharmakologische Substanzen zielgerichtet zu ihrem Wirkort zu transportieren und so die mangelnde Gewebsspezifitat konventioneller Wirkstoffe zu uberwinden. Humanes Serumalbumin bietet sich als Basis fur die Entwicklung verschiedenster Nanotherapeutika an, unter anderem da fur fluoreszenz-markiertes HSA eine selektive Anreicherung im Gewebe solider Tumoren nachgewiesen werden konnte. Aufgrund der hohen metabolischen Aktivitat eines Tumors und der Tatsache, dass Patienten mit progressiven malignen Erkrankungen haufig eine Kachexie und Hypoalbuminamie entwickeln, postulierten Stehle et al., dass HSA den Tumorzellen als Energie-und Stickstoffquelle dient und der Tumor selbst somit den Hauptort des Albumin-Katabolismus im Korper darstellt. In aufgereinigten Membranpraparationen von humanen Tumorzellen wurden Calreticulin und hnRNP A2/B1 als Albumin-bindende Proteine identifiziert. Zusammengenommen legt dies eine Beteilung dieser beiden Proteine an der HSA-Aufnahme in Tumorzellen nahe. In einem ersten Teil der Arbeit wurde die Anwesenheit von Calreticulin und hnRNP A2/B1 auf der Plasmamembran von lebenden Zellen durch Antikorperfarbung und FACS-Analyse uberpruft. Keines der beiden Proteine konnte auf der Oberflache von CCRF-CEM Zellen, einer humanen lymphoblastischen T-Zell Leukamie, nachgewiesen werden. Obwohl Calreticulin mittlerweile auf der Zellmembran von pre-apoptotischen, anthracyclin-vorbehandelten Zellen nachgewiesen wurde, konnte auch nach Induktion einer Apoptose durch Mitoxantron kein membranstandiges Calreticulin auf CCRF-CEM Zellen detektiert werden. Zur funktionellen Analyse der zellularen Albumin-Aufnahme wurde die Beteiligung der Clathrin-vermittelten Endozytose (CME), einem gut charakterisierten Mechanismus der Rezeptor-vermittelten Endozytose, an der Internalisierung von Alexa488-BSA in A240286S Zellen, einem humanen Lungenadenocarcinom, durch FACS-Analyse untersucht. Die Hemmung der CME wurde durch hypertone Bedingungen, intrazellularen Kaliummangel, Chlorpromazin und transiente Transfektion mit siRNA gegen Clathrin Heavy Chain, einem essentiellen Protein der CME, erreicht. Die reduzierte Aufnahme von Alexa488-Transferrin, einem Protein das selektiv durch den Transferrin-Rezeptor uber CME internalisiert wird, diente zur Uberprufung der erzielten Hemmung. Auch etablierte Methoden zur Hemmung einzelner Endozytose-Mechanismen sind nicht unbedingt selektiv und konnen einen Einfluss auf andere Mechanismen haben, zudem konnen sie in unterschiedlichen Zelllinien auch keine oder nur eine geringe Wirksamkeit zeigen sowie gegebenenfalls die Aufnahme des untersuchten Markers sogar verstarken. Die Ergebnisse der CME-Inhibition in A240286S Zellen bestatigen dies, da hypertone Bedingungen wahrend der Inkubation zwar die Aufnahme von Alexa488-Transferrin und Alexa488-BSA hemmten, gleichzeitig aber auch die Endozytose von Dextran, einem Marker fur die unspezifische Fluid-Phase Endozytose, reduzierten. Weder intrazellularer Kaliummangel noch Chlorpromazin zeigten eine Einfluss auf die Alexa488-Transferrin-Aufnahme. Der erfolgreiche Knock-Down von Clathrin Heavy Chain (CHC) konnte durch Western Blotting nachgewiesen werden und fuhrte zu einer deutlichen Verminderung der CME von Alexa488-Transferrin. Die Aufnahme von Alexa488-BSA hingegen zeigt nur eine geringe Hemmung durch siRNA CHC. Clathrin-vermittelte Endozytose leistet demzufolge entweder keinen oder nur einen geringen Beitrag zur Aufnahme von Albumin in A240286S Zellen. Zusatzlich zu der funktionalen Analyse der Albumin-Aufnahme wurde ein Protokol zur Isolation von HSA-Bindungspartnern aus der Plasmamembran von humanen Tumorzellen etabliert. Ein Teil des Protokols war die Synthese eines HSA-Konjugates, das sowohl einen photoaktivierbaren Crosslinker (SDAD) zur Konjugation an Albumin-bindende Proteine der Plasmamembran als auch einen Biotin-Tag zur selektiven Aufreinigung der Crosslinking-Produkte nach der Zelllyse enthielt. Zur Validierung des Protokols wurde ein vergleichbares Transferrin-Konjugat hergestellt, das zur Isolation des Transferrin-Rezeptors CD71 dienen sollte. Die Synthese beider Konjugate war erfolgreich, insbesondere enthielten beide Endprodukte keine hochmolekularen Verunreinigungen, reagierten nicht mit sich selbst und das Biotin-Tag war auch unter UV-Belichtung stabil. Durch FACS-Analyse konnten fur beide Konjugate eine extrazellulare Bindung und ein UV-induziertes Crosslinking nachgewiesen werden. Ein Western Blotting der Zelllysate bestatigte das erfolgreiche Crosslinking an Bindungspartner der Zellmembran. Das Protokoll zur Immunoprazipitation uber die Streptavidin-Biotin-Interaktion wurde fur beide Konjugate uberpruft. Eine Isolation des CD71 aus A240286S Zellen durch das Transferrin-Konjugates war jedoch bisher nicht erfolgreich. Eine rezeptorvermittelte Endozytose von HSA bzw. ein diskretes Albumin-bindendes Protein auf der Zellmembran von humanen Tumorzellen konnte in dieser Arbeit nicht nachgewiesen werden. Der Schluss liegt nahe, dass die Anreicherung von HSA-Konjugaten in soliden Tumoren vor allem auf dem „Enhanced Permeability and Retention“ Effekt, wie er auch fur andere Nanotherapeutika nachgewiesen wurde, und auf der langen Plasmahalbwertszeit des Proteins basiert.