慢病毒介导的shRNA干扰大鼠施万细胞RSC96 MYH14 基因的表达

目的 应用RNA干扰技术构建大鼠肌球蛋白重链14（ MYH14 ）基因重组慢病毒载体并鉴定。 方法 根据 MYH14 mRNA序列设计合成单链引物形成双链寡核苷酸序列，连接入经 Age Ⅰ和 BamH Ⅰ双酶切线性化的GV298慢病毒质粒载体中，菌液经PCR鉴定并测序验证。取测序正确的菌液提取质粒转染大鼠施万细胞RSC96，利用免疫荧光法观察转染效率，蛋白质印迹法筛选有效敲低 MYH14 的shRNA质粒，CCK-8法检测转染后RSC96细胞的活力。 结果 合成3对 MYH14 -shRNA序列并将其克隆到GV298载体中，构建了重组质粒 MYH14 -shRNA1、2、3，经菌液PCR鉴定和测序筛选出测序正确的载体 MYH14 -shRNA1和 MYH14 -shRNA2。免疫荧光检测结果显示转染72 h时RSC96细胞荧光表达最强；蛋白质印迹法检测结果显示，与阴性对照（scramble序列）组相比， MYH14 -shRNA2转染后RSC96细胞中MYH14蛋白的表达水平降低（0.57±0.15 vs 1.11±0.06， P MYH14 -shRNA1转染后MYH14蛋白表达水平差异无统计学意义（ P >0.05）。 MYH14 -shRNA2转染RSC96细胞24 h后的细胞活力与阴性对照组相比差异无统计学意义（1.09±0.16 vs 1.00±0.15， P >0.05）。 结论 成功构建大鼠 MYH14 基因重组慢病毒干扰载体，该载体能有效下调RSC96细胞中MYH14的表达。