Preclinical studies for the gene therapy of leukocyte adhesion deficiency type 1

La Deficiencia de Adhesion Leucocitaria Tipo I (DAL-I) es una inmunodeficiencia primaria producida por mutaciones en el gen ITGB2, que codifica para la proteina CD18 o subunidad s2. Esta proteina se asocia con diferentes subunidades CD11 para formar las integrinas s2, las cuales se expresan en la membrana de los leucocitos y les permiten adherirse al endotelio como paso previo a la extravasacion. Las mutaciones en el gen ITGB2 producen una reducida, ausente o aberrante expresion de CD18, lo que se traduce en la ausencia de integrinas s2 en la membrana leucocitaria. Los leucocitos de estos pacientes, principalmente los neutrofilos, son incapaces de abandonar el torrente sanguineo y combatir las infecciones que se producen en los diferentes tejidos. Asi, estos pacientes sufren infecciones bacterianas graves y recurrentes que pueden conducir a su muerte. En la presente tesis doctoral nos propusimos inicialmente caracterizar una cepa de raton que presenta una mutacion hipomorfica en el gen itgb2 (CD18HYP) para su posterior uso como modelo animal de DAL-I. Estos ratones mostraban una expresion baja pero detectable de integrinas s2 en celulas linfoides y mieloides y presentaban leucocitosis y defectos en la migracion de neutrofilos en respuesta a agentes inflamatorios. Sorprendentemente, la medula osea (MO) de estos ratones presentaba un mayor contenido de celulas madre hematopoyeticas (CMHs). Ademas, las celulas de MO de los ratones CD18HYP presentaban una mayor capacidad de repoblacion competitiva que las de un raton WT. A traves de diferentes experimentos in vivo observamos que la ausencia de CD18 conduce a la expansion del compartimento de CMHs incluso en presencia de un ambiente hematopoyetico WT, lo que demuestra por primera vez el papel de CD18 en la regulacion del nicho hematopoyetico. Al tratarse de una enfermedad hematopoyetica monogenica, DAL-I es una enfermedad idonea para ser tratada mediante terapia genica (TG) ex vivo. Por ello, generamos cuatro vectores lentivirales (VLs) autoinactivantes en los que la expresion del gen ITGB2 esta controlada por diferentes promotores, tanto ubicuos (PGK y UCOE) como mieloides (Chim y MIM). Estos VLs demostraron su eficacia para recuperar la expresion de integrinas s2 y corregir el fenotipo en dos modelos in vitro: una linea linfoblastoide derivada de un paciente con DAL-I y CMHs sanas interferidas para la expresion de CD18 (mediante la utilizacion de un VL que expresa un RNAsh capaz de reconocer el RNAm de CD18). Finalmente, pasamos a realizar experimentos de TG ex vivo en los ratones CD18HYP. Los ratones tratados por TG presentaban celulas en sangre periferica y en MO que expresaban la proteina humana CD18 (hCD18). Ademas, estas celulas presentaban una mayor expresion de la proteina endogena CD11a (mCD11a) en comparacion con ratones no tratados, lo que indicaba que la expresion ectopica de hCD18 rescataba la expresion de las integrinas s2 de raton. La expresion de hCD18 en todos los grupos tratados siempre fue mayor en neutrofilos que en linfocitos, aunque fueron aquellos ratones tratados con el vector LV:Chim.hCD18 en los que el ratio entre la expresion mieloide y la expresion linfoide fue mayor. Al retransplantar la MO de estos ratones, se observaron celulas hCD18+ con expresion incrementada de mCD11a en los receptores secundarios, lo que indicaba que los VLs-hCD18 eran capaces de transducir CMHs con capacidad de repoblacion a largo plazo. La recuperacion de valores normales de leucocitos en la sangre y el restablecimiento de la capacidad de extravasacion de los neutrofilos corroboraron la eficacia terapeutica de estos vectores. Aunque se obtuvieron resultados muy similares con todos los VLs, el promotor ideal para la TG de DAL-I seria aquel que expresase hCD18 en todas las celulas hematopoyeticas y que dirija una alta expresion en el linaje mieloide, puesto que es el tipo celular mas afectado por la deficiencia en esta proteina. Por eso, y en base a los resultados obtenidos, proponemos el uso del vector LV.Chim.hCD18 para un futuro ensayo de terapia genica en pacientes con DAL-I. Leukocyte Adhesion Deficiency Type I (LAD-I) is a primary immunodeficiency caused by mutations in ITGB2 gene, encoding for CD18 protein (also known as s2 subunit). This protein binds to different CD11 subunits to form s2 integrins, which are expressed in the leukocyte membrane and allow leukocytes to firmly adhere to the endothelium as a previous step to the extravasation. In LAD-I patients, ITGB2 mutations lead to absent, low or aberrant CD18 expression, which results in absent or low s2 integrin expression on the leukocyte membrane. CD18 deficient leukocytes, especially neutrophils, fail to extravasate from the bloodstream to infected tissues. LAD-I patients suffer from recurrent and severe infections leading normally to death. In the present doctoral thesis, we initially aimed to characterize a mouse strain presenting an hypomorphic mutation in the itgb2 gene (CD18HYP), which would be later used as a LAD-I animal model. These mice displayed low but still present s2 integrin expression in lymphoid and myeloid cells and showed leukocytosis and defects in neutrophil extravasation capacity in response to different inflammatory stimuli. Surprisingly, CD18HYP bone marrow (BM) showed enrichment in haematopoietic stem cells (HSCs). Moreover, BM cells from CD18HYP mice presented a higher competitive repopulation ability compared to WT cells. Through different in vivo experiments, we demonstrated that CD18 deficiency lead to the expansion of HSCs even in the presence of a WT haematopoietic environment, which pointed out the role of CD18 in the regulation of the haematopoietic niche for the first time. As a monogenic haematopoietic disorder, LAD-I is a good candidate for ex vivo haematopoietic gene therapy (GT). For this, we generated four lentiviral vectors (LVs) in which ITGB2 gene is expressed under ubiquitous (UCOE and PGK) or myeloid (Chim and MIM) promoters. These LVs succeeded in the CD18 expression and phenotype restoration in two different in vitro models: a lymphoblastic cell line derived from a LAD-I patient and in CD18-interferred healthy HSCs (generated by the use of a LV expressing a shRNA against the CD18 mRNA). Finally, we carried our GT experiments in CD18HYP mice. GT-treated CD18HYP mice showed peripheral blood and BM cells expressing hCD18 protein, which in addition showed higher expression of mCD11a subunit in comparison with untreated mice. This indicated that ectopic hCD18 expression restores murine s2 integrins. hCD18 expression was always higher in myeloid than in lymphoid cells in all treated groups, although LV.Chim.hCD18-treated animals showed the highest ratio between myeloid and lymphoid expression. When BM from these animals was re-transplanted into secondary recipients, hCD18+ cells with increased mCD11a expression could be observed, indicating that all CD18-LVs were able to transduce true and long-term HSCs. The recovery of normal number of leukocytes and the reestablishment of inflammation-mediated neutrophil extravasation capacity supported the therapeutic effect of these LVs Although similar results were obtained with all the hCD18-LVs, the ideal promoter for the GT of LAD-I would be the one driving a high expression of CD18 in the myeloid lineage but also expressing at a low level in other haematopoietic cells. For this reason, and on the basis of these results, we propose the use of LV.Chim.hCD18 for a future LAD-I GT clinical trial.