PADRONIZAÇÃO DE UM TESTE DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR UTILIZANDO SONDAS TAQMAN® PARA A DETECÇÃO DO GENE DO HALOTANO EM SUÍNOS

A hipertermia maligna e uma doenca muscular hereditaria conhecida como sindrome do estresse dos suinos (PSS), causada por varios fatores como estresse fisico, calorico, castracao, brigas entre animais, vacinacao e, inclusive, a administracao do anestesico halotano que desencadeia a morte de suinos afetados (homozigotos recessivos). Por isso, o gene responsavel por essa desordem e chamado de gene do halotano (HAL). Quando portador dessa sindrome, o animal apresenta uma mutacao do tipo SNP causal no gene receptor de rianodina1, ocorrendo troca de uma citosina, em animais normais, por uma timina, em animais afetados. A alteracao nesse receptor produz maior liberacao de calcio, aumentando as contracoes musculares e a liberacao de acido latico, desenvolvendo a carne PSE (exsudativa, palida e mole). Essa carne nao tem boa aceitacao no mercado por possuir caracteristicas indesejaveis como alta perda de agua, alem de gerar prejuizos para as industrias alimenticias. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi padronizar um teste de diagnostico do gene HAL em suinos utilizando sondas Taqman ® , como uma alternativa ao teste de diagnostico classico utilizado (PCR-RFLP). Foram realizadas extracoes de DNA do tecido de 36 amostras de suinos. Apos, as amostras foram submetidas a um teste utilizando a metodologia convencional de PCR-RFLP; os resultados foram analisados e armazenados. Para a metodologia de discriminacao alelica, foi utilizada a tecnica de PCR em tempo real (qPCR), na qual foram desenhados dois primers e duas sondas Taqman ® (Life Technologies), uma para o alelo C e outra para o alelo T. As reacoes de qPCR foram realizadas em equipamento 7500SDS (Applied Biosystems) utilizando para uma reacao final de 15 µL: Mastermix TaqMan ® Genotyping Master Mix na concentracao final 1X; 0,75 µL de ensaio 20x do HAL (Custom TaqMan ® SNP Genotyping Assays), contendo sondas e primers simultaneamente); 1 µL de DNA (25 ng/µL) e agua deionizada livre de DNAses e RNAses para completar a reacao. Ela foi colocada no equipamento de PCR Tempo Real com a ciclagem: 50 oC por 2 minutos; e 40 ciclos de 95 oC por 15 segundos e 60 oC por 1 minuto. Para verificar a especificidade do teste, as mesmas amostras genotipadas para o teste classico de PCR-RFLP foram utilizadas nos ensaios de qPCR. Das 36 amostras genotipadas por qPCR, foram observados os 3 genotipos possiveis (animais normais, portadores e afetados), demonstrando especificidade das sondas. Alem disso, quando os genotipos encontrados pelas duas metodologias foram comparados, houve uma concordância de 100% entre os dois testes. Dessa maneira, pode-se concluir que o teste utilizando a tecnologia de sondas Taqman ® e de PCR em tempo real pode substituir a tecnica PCR-RFLP no diagnostico do gene do halotano em suinos, por possuir a mesma precisao e eficiencia que a antiga tecnica empregada e em um menor periodo de tempo. Palavras-chave: Halotano. Suinos. Taqman ® .