Estratégias de detección de trampas extracelulares de neutrófilos (NETs)

INTRODUCCION: la NETosis es un mecanismo celular, descrito recientemente, en el que los neutrofilos liberan una red de cromatina y proteinas granulares al espacio extracelular en respuesta a microorganismos y otras moleculas activadoras. Estas redes llamadas trampas extracelulares de Neutrofilos (NETs) son capaces de atrapar y destruir germenes. In vitro es posible inducir la formacion de NETs usando estimulos como PMA (phorbol myristate acetate), LPS (lipopolisacarido), microorganismos y algunas citoquinas. Las NETs se visualizan por medio de microscopia de fluorescencia y se pueden cuantificar mediante espectrofluorimetria.  MATERIALES Y METODOS: 25 x104 neutrofilos aislados de sangre periferica son incubados por 30 minutos en RPMI a 37o C en 5% de CO2. Posteriormente se adiciona al medio PMA (25 nM) por un espacio de 90 minutos. Por ultimo, se hace la tincion con intercalantes de DNA como sytox Green (2.5 μM), Ioduro de propidio (2.5 ug/ml) o Hoechst (10 μg/ml). Los platos de cultivo son leidos por espectrofluorimetria para cuantificar la cantidad de NETs y las placas son  observadas en microscopia de fluorescencia. RESULTADOS PRELIMINARES Y CONCLUSIONES: hemos encontrado que al estimular los neutrofilos con PMA (25 nM), se observan estructuras compatibles con las NETs. Este proceso es dosis dependiente y se induce entre 60 y 120 minutos aproximadamente luego de adicionar el estimulo. Su visualizacion por microscopia de fluorescencia es posible mediante el uso de intercalantes de DNA como sytox Green, Ioduro de propidio y Hoechst. Hemos determinado que la cuantificacion de NETs se puede llevar a cabo por espectrofluorimetria. El DNA presente en el espacio extracelular se une a Sytox Green y la emision de fluorescencia se traduce en el porcentaje de NETs presentes.