Vectorización de nanopartículas magnéticas a través de células dendríticas para su utilización en terapia oncológica

Las celulas dendriticas (DCs, del ingles dendritic cells) son las principales celulas presentadoras de antigeno por lo que sus funciones mas importantes son la vigilancia y el control de las reacciones inmunologicas del individuo. Estas celulas actuan sobre todo en las primeras etapas de la activacion del sistema inmune, lo que conduce a una proteccion frente a patogenos y otros agentes extranos. Ademas, las DCs tambien tienen un papel crucial en la vigilancia inmunologica frente a celulas transformadas (Schmidt et al., 2012) y en la induccion de la respuesta anti- tumoral (Lorenzi et al., 2011; McDonnell et al., 2010; Tel et al., 2013). Aunque diversos estudios han mostrado que el sistema inmune puede participar en la eliminacion de celulas malignas, el hecho de inducir una respuesta inmune clinicamente eficaz es una tarea dificil dada la dinamica y compleja relacion existente entre el sistema inmune y el cancer. La gran plasticidad que han demostrado tener las DCs podria usarse a conveniencia para mejorar el diagnostico y para aplicar diferentes tratamientos en pacientes oncologicos. Por su alta capacidad fagocitica, las DCs son las celulas apropiadas para el transporte de nanoparticulas en su interior ya que evitan que estas sean reconocidas como extranas y eliminadas por el sistema reticulo endotelial, actuando asi como un “Caballo de Troya”. Ademas, hay que destacar tambien la “capacidad” que tienen las DCs de adquirir propiedades angiogenicas in vivo bajo condiciones patologicas (Conejo-Garcia et al., 2004). Esta capacidad hace que puedan llegar a formar parte del entramado vascular tumoral, no solo por la presencia de factores de crecimiento o de determinadas citoquinas secretadas en el microambiente tumoral que condiciona a las DCs, sino tambien de las interacciones fisicas entre celulas asi como con la matriz extracelular (Sprague et al., 2014). Estas propiedades hacen que las DCs sean una herramienta idonea tanto para detectar el cancer como para aplicar una terapia localizada frente al tumor. Asi, las DCs podrian actuar como vectores para transportar en su interior nanoparticulas magneticas (MNPs) y hacerlas llegar hasta el tumor. Posteriormente, tras aplicar un campo magnetico, las MNPs liberarian energia en forma de calor (hipertermia magnetica), lo que ayudaria a destruir de una forma localizada los vasos tumorales e impediria el crecimiento del tumor asi como la migracion de celulas malignas a focos secundarios. El objetivo global de esta Tesis Doctoral es determinar el papel de factores secretados por celulas tumorales en la trans-diferenciacion de las celulas dendriticas en celulas con caracteristicas de celulas endoteliales y estudiar la biodistribucion de las nanoparticulas magneticas vectorizadas a traves de celulas dendriticas utilizando un modelo de melanoma murino. Para llevarlo a cabo se establecieron cultivos de celulas dendriticas, tanto humanas como murinas, se realizaron co-cultivos en presencia de lineas celulares tumorales establecidas, o con adicion de sus sobrenadantes o de VEGF exogeno. Se estudiaron por citometria de flujo marcadores caracteristicos de celulas dendriticas asi como de celulas endoteliales. Por otra parte, se establecieron las condiciones de implantacion de un modelo de melanoma murino (via de inoculacion, dosis celular, y tiempo de crecimiento) ayudados por la monitorizacion del proceso mediante bioluminiscencia y la resonancia magnetica de imagen (MRI). Una vez establecido, se realizo un ensayo para estudiar la biodistribucion de las DCs cargadas con MNPs en este modelo animal. Para ello las DCs murinas fueron cultivadas con MNPs, y tras comprobar que estas no afectaban a la viabilidad celular, se inyectaron en los animales en diferentes formas de administracion: celulas dendriticas inmaduras o maduras, via peritumoral o intraperitoneal. Tras recoger diferentes organos, se analizo en ellos la presencia de hierro debida a las MNPs transportadas por las DCs midiendo el tiempo de relajacion del agua, T2, en un magnetometro MINISPEC. En los ensayos de co-cultivos de DCs, tanto humanas como murinas, se observo un proceso de trans-diferenciacion de DCs a endothelial-like cells, aumentando la expresion de marcadores caracteristicos de celulas endoteliales como son VEFGR-2 o KDR y de vWF, mientras se mantenian algunos caracteristicos de DCs, principalmente cuando se adicionaron al cultivo sobrenadantes de cultivos de celulas tumorales. En nuestro trabajo inicial de biodistribucion realizado in vivo con ratones, hemos observado por resonancia magnetica de imagen que las DCs que contenian las MNPs podian llegar, por via sanguinea, a los ganglios linfaticos tras ser inoculadas en el animal por la vena caudal. Cuando estas son inoculadas via peritumoral o via intraperitoneal, no se encontraron diferencias significativas en ninguno de los organos analizados (bazo, higado, pulmon, rinon y tumor), con respecto al control, en la cantidad de hierro perteneciente a las MNPs, independientemente de si son incorporadas por las celulas dendriticas inmaduras y maduras. Sin embargo, cuando se comparo la cantidad de hierro en el tumor entre los distintos grupos de administracion de DCs+MNPs, el valor mas alto y el unico estadisticamente significativo, se obtuvo cuando se inocularon las celulas dendriticas cargadas con MNPs en el estadio inmaduro y por la via peritumoral. De nuestros resultados se deriva que deberia aumentarse el numero de DCs inoculadas en la zona tumoral para aumentar asi la cantidad de MNPs, monitorizarlas mediante RMI en los animales vivos, y someterlos despues a estos a tratamientos de hipertermia para ver si se produce una reduccion del tumor. Tambien se deberian realizar un analisis del tumor y la region peritumoral, mediante inmunohistoquimica, para conocer si las DCs con MNPs presentes en la zona tumoral presentan un fenotipo mixto de DCs y endothelial-like cells, a la vez que determinar la presencia de hierro en esa zona. Bibliografia • Conejo-Garcia, J.R., Benencia, F., Courreges, M.C., Kang, E., Mohamed-Hadley, A., Buckanovich, R.J., Holtz, D.O., Jenkins, A., Na, H., Zhang, L., Wagner, D.S., Katsaros, D., Caroll, R., Coukos, G., 2004. Tumor-infiltrating dendritic cell precursors recruited by a beta-defensin contribute to vasculogenesis under the influence of VEGF-A. Nat Med 10, 950–958. • Lorenzi, S., Mattei, F., Sistigu, A., Bracci, L., Spadaro, F., Sanchez, M., Spada, M., Belardelli, F., Gabriele, L., Schiavoni, G., 2011. Type I IFNs control antigen retention and survival of CD8α(+) dendritic cells after uptake of tumor apoptotic cells leading to cross-priming. J Immunol 186, 5142–50. • McDonnell, A.M., Prosser, A.C., Van Bruggen, I., Robinson, B.W.S., Currie, A.J., 2010. CD8α+ DC are not the sole subset cross-presenting cell-associated tumor antigens from a solid tumor. Eur J Immunol 40, 1617–1627. • Schmidt, S.V., Nino-Castro, A.C., Schultze, J.L., 2012. Regulatory dendritic cells: There is more than just immune activation. Front Immunol 3, 1–17. • Sprague, L., Muccioli, M., Pate, M., Singh, M., Xiong, C., Ostermann, A., Niese, B., Li, Y., Li, Y., Courreges, M.C., Benencia, F., 2014. Dendritic cells: in vitro culture in two- and three-dimensional collagen systems and expression of collagen receptors in tumors and atherosclerotic microenvironments. Exp Cell Res 323, 7–27. • Tel, J., Schreibelt, G., Sittig, S.P., Mathan, T.S.M., Buschow, S.I., Cruz, L.J., Lambeck, A.J.A., Figdor, C.G., De Vries, I.J.M., 2013. Human plasmacytoid dendritic cells efficiently cross-present exogenous Ags to CD8+ T cells despite lower Ag uptake than myeloid dendritic cell subsets. Blood 121, 459–467.