Engineering apolipoprotein a-i as a molecular scaffold: generation of interapo

El interferon fue descubierto hace mas de 50 anos, como un inhibidor de la replicacion del virus influenza. Actualmente la familia de citoquinas de IFN se reconoce como un componente clave en la respuesta sistema inmune innato, y en la primera linea de defensa frente a infecciones virales. La corta vida media del IFNα sin modificar hace necesaria la administracion frecuente del farmaco durante largos periodos de tiempo. Por ello se han estudiado varias estrategias para conseguir la estabilizacion de la proteina, como la union del IFNα a polietilenglicol, o la fusion genica de la albumina con el IFNα. A pesar de su eficacia clinica, el tratamiento con IFNα produce efectos secundarios: (i) neuropsiquiatricos, (ii) trombocitopenia, (iii) y leucopenia. Por ello planteamos que la vectorizacion de IFN al higado, favorezca su actividad localizada, y disminuya los efectos adversos. Se identifico una proteina fisiologica, que no desencadene respuesta inmunologica frente a si, con una larga vida media, y de localizacion hepatica: Las lipoproteinas de alta densidad (HDLs) poseen propiedades anti-aterogenicas, debido a que pueden retirar el colesterol de las arterias, y transportarlo de vuelta al higado para su excrecion. Dichos efectos son principalmente debidos a la Apolipoproteina A-I (apoA-I), proteina mayoritaria de la particula de HDL. La Apo A-I es una proteina de bajo peso molecular, que una vez libre en plasma mayoritariamente se acompleja formando HDLs, mientras que solo el 3.7%-8.1% restante circula en la forma libre. La vida media de la Apo A-I es de 15 - 54 h. Se ha demostrado ademas que tras la administracion sistemica de apo A-I, esta se biolocaliza en el higado. Se clonaron los genes del IFNα de raton seguido del gen de la apo A-I murina. Este plasmido codifica para una proteina de fusion que a partir de ahora denominamos InterApo (IA). La administracion de esta proteina quimerica, tanto por via de terapia genica, como por inyeccion intravenosa de la proteina recombinante, demostro un aumento de la vida media del IFNα de 2.6 a 5 veces. Otro aspecto fundamental estudiado fue la biodistribucion. Tras 150 min. de tratamiento con 1µg de rIFN o rIA hemos demostrado que podemos detectar por ELISA la presencia de rIA mayoritariamente en higado, y trazas tambien a nivel pulmonar y de bazo, mientras que a ese tiempo no es posible detectar rIFN en ningun organo. La actividad de los interferones de tipo I esta mediada por proteinas codificadas por genes inducibles por interferon (ISGs). Para comprobar si la construccion quimerica mantenia dicha capacidad, se analizo los niveles de ARNm de 2?-5? OAS, USP18, e ISG15 tres dias tras la inyeccion hidrodinamica o 24 h tras la inyeccion intravenosa de las proteinas recombinantes. Las construcciones quimericas aumentan los niveles de ARNm de los ISGs estudiados en higado, indicando la dianizacion al higado de la construccion. Hemos aislado el gen de la Apo A-I de marmota. Esto ha permitido generar la proteina InterApo de Marmota monax, unico animal que sufre una hepatitis viral comparable a la de HBV humano. Esta proteina de fusion se introdujo en un vector viral adenoasociado, que se inyecto via intrahepatica a una marmota infectada con WHV, que a diferencia con las marmotas control tratadas con AAV-IFN, continua viva, y sin sintomas de toxicidad hematologica derivadas del tratamiento cronico con IFN, tras mas de 13 meses post-laparotomia. Esta disminucion de toxicidad se observa tambien en ratones Balb/c y C57/BL6, tras el tratamiento con altas dosis de IA no presentan leucopenia, y la trombocitopenia es significativamente mayor en el grupo que recibe IFN. Ademas los animales tratados con esta formulacion, son capaces de generar una lisis especifica frente a epitopos especificos de antigeno mediada por linfocitos T citotoxicos (CTLs) muy superior a la conseguida con el tratamiento de IFN.