重组质粒pcDNA3．1（＋）／HSP70-Endo／EGFP的构建及在HepG2细胞的表达

目的构建热休克蛋白70（HSP70）启动子调控内皮抑素（Endo）基因的重组质粒pcDNA3．1（＋）／HSP70－Endo／EGFP，观察其在HepG2细胞中的表达规律。方法用聚合酶链反应（PCR）法体外扩增HSP70启动子（350bp）；用EcoRI、SalI双酶切法切取质粒pSP—Endo／EGFP中Endo／EGFP，克隆到pcDNA3．1（＋）中获得重组质粒pcDNA3．1（＋）／HSP70-Endo／EGFP。脂质体介导转染HepG2细胞，转染24h后予以37、39、41、43、45℃加热诱导30min，荧光显微镜和流式细胞术检测EGFP的表达，逆转录（RT）－PCR法检测细胞内EndomRNA的表达；ELISA法检测转染细胞上清中Endo蛋白浓度。结果合成HSP70启动子序列测序结果与GeneBank中AL671762所提供序列完全一致。低温加热可增强HepG2细胞中Endo／EGFP表达，43℃组EGFP表达强度达37℃组的3．3倍。43℃组EndomRNA表达水平高于不加热组。43℃组上清Endo蛋白浓度为（177±28）μg/L，高于不加热组（43±11）μg/L。结论成功构建HSP70启动子调控Endo基因的重组质粒，低温加热可增强HepG2细胞中Endo基因的表达。