hVEGF165 及hBMP-7 共表达重组腺相关病毒载体介导基因表达的时效性研究

目的 探讨hVEGF165 及hBMP-7 共表达重组腺相关病毒载体（recombinant adeno-associated virus，rAAV）介导基因表达的时效性，为体内应用其进行骨坏死的基因治疗奠定理论基础。 方法 应用荧光细胞计数法测定rAAV 转染兔BMSCs 的最佳转染复数。分别采用rAAV-hVEGF165- 内部核糖体进入位点序列（internal ribosome entry site，IRES）- hBMP-7（实验组）、绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）标记平行对照rAAV-IRES-GFP（对照组）在最佳转染复数条件下转染体外培养的第3 代兔BMSCs。于不同时间点分别行GFP 表达检测、RT-PCR 检测、Western blot 检测明确rAAV 体外介导基因表达的时效性关系。将实验组及对照组病毒转染后的BMSCs 以5 × 106 个/ mL 密度，分别注射至9 只2 月龄纯种雄性新西兰大耳白兔制备的肌袋模型内各1 mL（实验组1 及对照组1），于不同时间点分别行GFP表达检测、Western blot 检测及ELISA 检测明确rAAV 体内介导基因表达的时效性关系。 结 果 rAAV 转染兔BMSCs的最佳转染复数为5 × 104 v.g/cell。通过体外检测显示rAAV 转染BMSCs 后1 d 即有目的基因表达，14 d 时表达强度明显增强，至28 d 时仍维持较强表达。通过体内检测显示体内转染2 周可检测到目的基因表达，6 周时表达强 度增强，8 周时仍维持较高水平。ELISA 法检测实验组1 细胞培养上清中hVEGF165 和hBMP-7 含量分别为（248.67 ± 75.58）pg/mL 和（4.80 ± 0.61） ng/ mL， 对照组1 分别为（32.28 ± 8.42）pg/mL 和（0.64 ± 0.42）ng/mL，两组比较差异均有统计学意义（P lt; 0.05）。 结论 双基因共表达rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7 具有较好的转染时效性。