INVESTIGAÇÃO DO POTENCIAL CITOTÓXICO E GENOTÓXICO DO TEMOZOLOMIDA EM LINHAGEM CELULAR DE GLIOBLASTOMA MULTIFORME HUMANO U87MG

Os Glioblastomas Multiformes (GBM) sao tumores caracterizados pela invasao e destruicao ao tecido cerebral e resistencia a radioterapia e quimioterapia. O uso do Temozolodamida (TMZ) como complemento a radioterapia pos-operatoria em pacientes com GBM mostra sinais de que a sobrevida dos pacientes aumenta devido a sua eficacia e baixa toxicidade ao individuo. O Objetivo desse trabalho e investigar o potencial genotoxico e citotoxico do TMZ em linhagem celular de glioblastoma multiforme humano U87MG. A linhagem U87MG foi mantida em meio de cultura DMEM suplementado com 15% de soro fetal bovino em condicoes padrao de cultivo. Inicialmente, a linhagem celular U87MG foi tratada com doses seriadas de TMZ por 72 h. 24 h antes dos tratamentos com os farmacos, as celulas foram incubadas em microplacas de 96 pocos, em uma densidade de 4 x 10 4 celulas/100 µL/poco. A citotoxicidade foi avaliada utilizando o ensaio colorimetrico de Sulforodamida B (SRB). A partir deste ensaio determinamos os valores de IC 50 (quantidade de farmaco necessaria para inibir 50% do crescimento celular). Estes foram realizados em triplicata. A deteccao de danos ao DNA foi realizada pelo ensaio cometa. Neste teste foram adicionadas doses de IC 20 (89 µM), IC 50 (355 µM) e IC 70 (830 µM) de TMZ, por 24 h, alem do controle nao tratado. As celulas a serem analisadas foram homogeneizadas com gel de agarose de baixo ponto de fusao, distribuidas sobre lâminas de vidro previamente cobertas com gel de agarose de ponto de fusao normal. Apos serem mergulhadas em solucao de lise foram submetidas a eletroforese em condicoes alcalinas (pH>13). A seguir foram coradas com brometo de etidio para que os nucleos das celulas portadoras de quebras de DNA fossem visualizadas sob a forma de um cometa, em microscopio de fluorescencia (Olympus BX51). Um total de 100 celulas foram analisadas por amostra. Os nucleos intactos aparecem redondos, enquanto que nas celulas lesadas, o DNA livre migra do nucleo em direcao ao ânodo, mostrando uma cauda de fragmentos, semelhante a um cometa. Estes fragmentos podem se apresentar em diferentes tamanhos, e ainda estar associados ao nucleo por uma cauda simples. A classificacao dos cometas foi realizada por meio de um software ( Comet Assay IV - Perceptive ) acoplado ao microscopio. O parâmetro utilizado para a avaliacao de danos foi a % de DNA na cauda ( tail intensity ). O TMZ e um agente que induz alquilacao na posicao O 6 da guanina, ocorrendo tambem alquilacao adicional na posicao N 7 , levando a celula a morte por dano ao DNA. Na avaliacao da citotoxicidade se determinou o IC 50 (355 µM). Pode ser observado no ensaio cometa um aumento consideravel de dano genotoxico com o aumento da dose, sendo o efeito mais significativo em doses acima de 355 µM . Contudo nao se ve uma diferenca significativa nos danos obtidos nas celulas expostas tanto a 355 µM quanto a 830 µM.