Structure-based methods for virtual screening, protein design, and protein function studies

The average time a drug requires to successfully appear into the market is around 15-20 years. Structure-based techniques play a determinant role in many moments of this long process and computer-based approaches are becoming always more popular, for they are cheap and fast. Computer-based approaches to structure-based drug discovery are also very common in Academia, both in the field of development and application. Moreover, most of the software currently used in this field is being developed in Academia. In this doctoral thesis two main topics are covered: virtual screening by the means of docking and the application of molecular dynamics simulations to macromolecular systems of interest. Two projects employed virtual screening: the search for inhibitors of cathepsin B and the search for allosteric effectors of cathepsin K. The two projects are ideally linked because in both the active site of the enzyme was not targeted. In the cathepsin B project, the so called occluding loop was chosen to show that inhibition of this enzyme could be obtained without targeting the active site. In the cathepsin K project, a putative allosteric pocket was targeted. The pocket was found by a method that considers the residue conservation in evolutionarily linked protein families and then confirmed by two independent structure-based methods. Two other projects involved molecular dynamics simulations of biological macromolecules: designed armadillo repeat proteins and the CRY1 protein of Arabidopsis. In both projects, the evaluation of local and conformational flexibility played a major role. The first one employed static homology modelling and molecular dynamics simulations not only to generate a putative structure of an armadillo repeat protein, but also for improving its dynamical behavior, which could not have been inferred from a static structure only. The second project helped to explain the effect of a single-point mutation of the CRY1 protein of Arabidopsis thaliana. Molecular dynamics simulations of the two systems were run and the difference of activity between them was explained in terms of different flexibility of the protein surface close to the mutation. Die durchschnittliche Zeit, die ein Medikament braucht, um erfolgreich auf den Markt zu kommen, betragt 15-20 Jahre. Struktur-basierte Methoden spielen eine entscheidende Rolle an vielen Stellen dieses langen Prozesses und computer-basierte Ansatze werden immer beliebter, da sie kostengunstig und schnell sind. Computer-basierte Ansatze fur die struktur-basierte Identifikation neuer Medikamente werden sehr haufig in der Wissenschaft verwendet, sowohl auf dem Gebiet der Entwicklung als auch fur Anwendungen. Daruber hinaus wird ein Grossteil der aktuellen Software dieses Gebiets in der Wissenschaft entwickelt. In dieser Doktorarbeit werden zwei Hauptthemen behandelt: virtuelles Screening durch Docken und die Anwendung von Molekuldynamik-Simulationen auf makromolekulare Systeme. Bei zwei Projekten wurde virtuelles Screening verwendet: die Suche nach Inhibitoren von cathepsin B und die Suche nach allosterischen Effektoren von cathepsin K. Die zwei Projekte sind ideal miteinander verbunden, da beide nicht auf das aktive Zentrum der Enzyme abzielten. Im cathepsin B Projekt wurde die sogenannte “occluding loop” gewahlt um zu zeigen, dass das Enzym inhibiert werden kann, ohne das aktive Zentrum des Enzyms anzugreifen. Im cathepsin K Projekt wurde eine mutmassliche allosterische Bindungsstelle ausgewahlt. Die Bindungstasche wurde mit Hilfe einer Methode gefunden, die den Erhalt der Aminosauresequenz bei evolutionar verbundenen Proteinfamilien berucksichtigt, und anschliessend durch zwei unabhangige struktur-basierte Verfahren bestatigt. Zwei weitere Projekte beinhalten Molekuldynamik-Simulationen von biologischen Makromolekulen: entworfene Armadillo Repeat-Proteine und das CRY1 Protein der Arabidopsis. In beiden Projekten spielte die Evaluation der lokalen und konformationellen Flexibilitat eine zentrale Rolle. Beim ersten wurden statisches Homologie-Modelling und Molekuldynamik-Simulationen verwendet, um nicht nur eine mutmassliche Struktur eines Armadillo Wiederholungsproteins zu generieren, sondern auch sein dynamisches Verhalten zu verbessern, das allein aus einer statischen Struktur nicht hatte abgeleitet werden konnen. Das zweite Projekt diente der Erklarung der Auswirkung einer Einzelmutation des CRY1 Proteins von Arabidopsis thaliana. Molekuldynamik-Simulationen beider Systeme (Wildtype und Mutierter) wurden durchgefuhrt und der Unterschied ihren Aktivitaten mit einer unterschiedlichen Flexibilitat der Proteinober#ache in ortlicher Nahe zur Mutation erklart.