Development of new therapies based on the non-canonical functions of the RNA component of telomerase

espanolLa telomerasa es un complejo ribonucleoproteico compuesto principalmente por una subunidad catalitica con actividad retrotranscriptasa (telomerase reverse transcriptase, TERT) y un componente de RNA (telomerase RNA component, TERC), encargado del mantenimiento de los telomeros. Sin embargo, diversos estudios sostienen que ambos componentes realizan diversas funciones mas alla del mantenimiento telomerico. En concreto, nuestro laboratorio ha descubierto que TERC regula la mielopoyesis, tanto en pez cebra como en humano. Los objetivos de este trabajo son: 1. Caracterizacion molecular de los dominios TERC responsables de su funcion hematopoyetica. 2. Desarrollo de aptameros derivados de TERC para tratar enfermedades hematologicas. 3. Identificacion del interactoma de TERC. Metodologia, resultados y conclusiones: Durante el desarrollo de esta Tesis Doctoral se han aprovechado las incuestionables ventajas del pez cebra para estudiar el papel de terc en la mielopoyesis, caracterizando la implicacion funcional de cada uno de sus dominios en este proceso. Para investigar la funcion de cada dominio, se reprodujeron diferentes mutaciones que se encuentran con frecuencia en pacientes con disqueratosis congenita (DC) y se observo que solo las mutaciones que afectan al dominio CR4/CR5 alteran la mielopoyesis. Aprovechando el conocimiento funcional del dominio CR4/CR5 de TERC en la mielopoyesis, se desarrollaron varios aptameros (pequenos oligonucleotidos sinteticos, capaces de reconocer especificamente y con gran afinidad moleculas diana). Dos de los aptameros, CR4CR5 y AA, fueron capaces de estimular la mielopoyesis aumentando el numero de neutrofilos y macrofagos, sin afectar el numero de eritrocitos, e independientemente de la expresion de terc o la actividad de la telomerasa. Ademas, funcionaban como terc; es decir, interactuaron con la RNA polimerasa II y con las secuencias de union a terc presentes en el promotor de los genes clave en la mielopoyesis, mejorando su expresion de manera dependiente del sitio de union de terc. Es importante destacar que los aptameros que albergan mutaciones en CR4/CR5, que se encuentran en pacientes con DC, no lograron realizar todas estas funciones. Ademas, los modelos preclinicos de pez cebra de DC (deficiencia de terc) y poiquilodermia con neutropenia (deficiencia de usb1) demostraron el potencial terapeutico de los aptameros desarrollados para tratar la neutropenia. Finalmente, los aptameros humanos correspondientes tambien aumentaron la expresion del gen mieloide promoviendo la mielopoyesis en celulas madre pluripotentes inducidas de humano. Por lo tanto, en este estudio se han desarrollado dos agentes terapeuticos potenciales para DC y otras enfermedades neutropenicas. Aunque profundizamos en las caracteristicas estructurales y funcionales de TERC durante esta tesis, decidimos que aun era posible explorar su potencial mas alla de su papel en la biologia telomerica y su papel no canonico en la mielopoyesis. Por esta razon, se desarrollo un enfoque proteomico para aprovechar al maximo el potencial de TERC. De esta manera, se ha descubierto que TERC interactua potencialmente con una multitud de proteinas, involucradas en varios procesos celulares, como el plegamiento, degradacion (ubiquitinacion) y traduccion de proteinas, metabolismo de carbono y lipidos, desintegracion de RNAm mediada por mutaciones de perdida de sentido, biogenesis mitocondrial y ciclo celular. Por otro lado, terc con las mutaciones en el dominio CR4/CR5 encontradas en pacientes con DC mostro un interactoma similar a terc control, a pesar de que estas mutaciones alteran tanto la actividad de la telomerasa, como la regulacion de la mielopoyesis dependiente de TERC. Este estudio es el primer paso hacia futuros estudios funcionales destinados a la caracterizacion de las funciones no canonicas de terc, que podrian ayudar a mejorar el diagnostico y el tratamiento de pacientes con mutaciones TERC. EnglishTelomerase is a ribonucleoprotein complex mainly composed of a catalytic subunit with reverse transcriptase activity (telomerase reverse transcriptase, TERT) and an RNA component (telomerase RNA component, TERC), responsible for telomere maintenance. However, several studies confirm that both components perform others functions beyond telomeric role. Specifically, our laboratory has discovered that TERC regulates myelopoiesis, both in zebrafish and in humans. The specific objectives of the present work are: 1. Molecular characterization of the TERC domains responsible of its non-canonical hematopoietic function. 2. Development of aptamers derived from TERC to treat blood diseases. 3. Identification of TERC interactome. Methodology, results and conclusions: During the development of this Doctoral Thesis, we have exploited the unquestionable advantages of the zebrafish to study the role of terc in myelopoiesis, characterizing the functional involvement of each terc domain in this process. To investigate the function of each domain, different mutations that are frequently found in patients with dyskeratosis congenita (DC) were reproduced and we observed that only the mutations affecting the CR4/CR5 domain impaired myelopoiesis. Taking advantage of the functional knowledge of the roles played by the CR4/CR5 domain of TERC in myelopoiesis, several aptamers (small synthetic oligonucleotides, capable of specifically recognizing target molecules with high affinity) were developed. Two of the aptamers, CR4CR5 and AA, were able to stimulate myelopoiesis by increasing the number of neutrophils and macrophages, without affecting the number of erythrocytes, and independently of terc expression or telomerase activity. In addition, they functioned as terc; that is, they interacted with RNA polymerase II and with the terc binding sequences present in the promoter of master myelopoiesis genes, enhancing their expression in a terc binding site-dependent manner. Importantly, aptamers harbouring CR4/CR5 mutations found in DC patients failed to perform all these functions. In addition, preclinical zebrafish models of DC (terc deficiency) and poikiloderma with neutropenia (usb1 deficiency) diseases demonstrated the therapeutic potential of the developed aptamers to treat neutropenia. Finally, the corresponding human aptamers also increased myeloid gene expression promoting myelopoiesis in human induced pluripotent stem cells. Therefore, two potential therapeutic agents for DC and other neutropenic diseases have been developed in this study. Although we delved into TERC structural and functional characteristics during this thesis, we decided that it was still possible to explore its potential beyond its role in telomeric biology and its non-canonical role in myelopoiesis. For this reason, a proteomic approach was developed to fully exploit the potential of TERC. By this way, it has been discovered that TERC potentially interacts with a multitude of proteins, involved in several cellular processes, such as protein folding, degradation (ubiquitination) and translation, carbon and lipid metabolism, nonsense-mediated mRNA decay, mitochondrial biogenesis and cell cycle. Notably, terc harbouring the mutation of the CR4/CR5 domain found in DC patients showed a similar interactome as wild type terc, despite these mutations impair both telomerase activity and TERC-dependent regulation of myelopoiesis. This study paves the way for future functional studies aimed at the characterization of the non-canonical roles of terc that could help in improving diagnosis and treatment of patients with TERC mutations.