Molekularbiologische Studien zur Pathogenität und Ökologie von Legionella pneumophila

Legionella pneumophila, der Erreger der Legionarskrankheit, ist ein Umweltkeim mit Verbreitung in aquatischen Habitaten. Die Keime sind in der Lage, sich intrazellular in eukaryontischen Zellen, wie Makrophagen, Monozyten und Protozoen zu vermehren. Die erfolgreiche Besiedlung okologischer Nischen, aber auch das Virulenzpotential des Keimes konnen dabei von Umweltfaktoren abhangen. Die Erforschung okologischer Zusammenhange kann daher fur das Verstandnis der bakteriellen Virulenz von groser Bedeutung sein. Ausgangspunkt dieser Arbeit ist die in der spaten stationaren Phase des Bakterienwachstums von L. pneumophila zu beobachtende intensive Pigmentierung des Kulturmediums. Fur diesen Phanotyp ist das Legiolysin (Lly) verantwortlich. Es ist eines der wenigen bekannten Genprodukte von L. pneumophila, die einen Einflus auf das Uberleben des Keimes in der Umwelt haben. Legiolysin kann daher als Fitnessfaktor bezeichnet werden. Um die okologischen Zusammenhange der Pigmentgenerierung naher zu untersuchen, wurde das lly-positive Plasmid pEWL 1 subkloniert und sequenziert. Neben lly konnten in diesem Genabschnitt durch Sequenzvergleiche der abgeleiteten Aminosauresequenzen sechs weitere Leseraster detektiert werden. Die drei unmittelbar benachbarten Gene von lly kodieren dabei fur Proteine mit Funktionalitat in Bezug zur lly-Determinante, wahrend die drei upstream von lly liegenden Leseraster Homologien zu Proteinen aufweisen, die an Transportprozessen beteiligt sind. Die Lange des RNA-Transkripts von lly konnte im Northern-Blot mit ungefahr 1,8 kb bestimmt werden und last damit auf die gemeinsame Transkription des lly-Gens mit dem unmittelbar upstream liegenden Leseraster schliesen. Durch Sequenzanalysen konnte aufgezeigt werden, das das fur diesen Phanotyp verantwortliche Legiolysin-Gen fur eine p-Hydroxyphenylpyruvat-Dioxygenase (HPPD) kodiert. Dieses Enzym katalysiert die Umsetzung von p-Hydroxyphenylpyruvat zu Homogentisat (HGA). In Zusammenarbeit mit Prof. P. Proksch (Pharmazeutische Biologie, Wurzburg) konnte im Vergleich zu lly-negativen L. pneumophila- und rekombinanten E. coli-Stammen in den Kulturuberstanden von lly-positiven Stammen auf Basis einer Hochdruck-Flussigkeits-Chromatographie (HPLC) HGA nachgewiesen werden. Es konnte somit gezeigt werden, das das Legiolysin-Gen fur ein Protein mit HPPD- Aktivitat kodiert, und in die Degradation der aromatischen Aminosauren Phenylalanin und Tyrosin involviert ist. Des weiteren wurden chromosomale Integrationsmutationen der aus L. pneumophila stammenden Gene lly und mip ("macrophage infectivity potentiator") in E. coli K-12 Stammen erstellt. Diese wurden nachfolgend in okologisch ausgerichteten Langzeitstudien eingesetzt. Die chromosomale Integration von lly erfolgte als ortsspezifische Rekombination in die l att - site von E. coli WM 2269. Die Integration von mip erfolgte in die fim-Region des E. coli K-12-Stammes AAEC 160. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit befast sich mit okologischen Studien zur Persistenz von L. pneumophila in der Umwelt. Durch die Bestrahlung mit Licht uber einen Verlauf von sieben Tagen konnte gezeigt werden, das die Exprimierung von lly zu einer Persistenz unter Lichtstres fuhrt. Dieser Lichtschutz konnte in der Umwelt, aber auch bei der Sanierung von Wasserleitungssystemen mittels UV-Licht Relevanz aufweisen. Die Assoziation von L. pneumophila JR32 und JR32-1 (lly-negativ) mit dem Cyanobakterium Fischerella wurde in Mikrokosmen uber einen Verlauf von sieben Tagen beobachtet. Dabei konnte gezeigt werden, das Legionella in Assoziation mit Fischerella bzw. in dessen Uberstand zu persistieren vermag, wahrend dies den Bakterien in frischem Fischerella-Medium nicht moglich war. Wie die Coinkubation der Fischerellen mit L. pneumophila JR32-1 zeigte, spielt die Expression von lly dabei keine Rolle. Ein Wachstum der Bakterienkulturen konnte weder im Fischerella-Uberstand, noch in Fischerella-Medium beobachtet werden. Durch Rasterelektronenmikroskopie konnte der adhasive Charakter der Assoziation von L. pneumophila zu Fischerella dokumentiert werden. Durch Persistenzstudien von L. pneumophila und E. coli in Boden wurde die Uberlebensfahigkeit der Mikroorganismen in suboptimaler Umgebung getestet. Fur Legionella ist eine rapide Abnahme der Zellzahl schon nach kurzer Zeit zu detektieren. Nach sechs Tagen konnten keine Zellen mehr kultiviert werden. Die Defizienz der Pathogenitats- und Umweltfaktoren Mip, Fla (Flagellin) und Lly hatte dabei keinen Einflus auf die Persistenz der Bakterien im Boden. Zudem sind die zuvor generierten rekombinanten E. coli-Klone AAEC 160-1 und WM 2269-1 mit genomischer mip- bzw. lly-Integration eingesetzt worden. Innerhalb von vier Wochen konnte fur diese Stamme eine kontinuierliche Reduktion der Zellzahlen beobachtet werden. Somit erwies sich keiner der Organismen als erfolgreicher Besiedler der Bodenprobe. Die Studien zum Verlust der Kultivierbarkeit von L. pneumophila und E. coli erfolgten in autoklaviertem Leitungswasser bzw. PBS und zwei unterschiedlich behandelten Varianten von Mainwasser. Neben sterilfiltriertem Mainwasser fand die Inokulierung der Organismen auch in einem Ansatz mit autoklaviertem Mainwasser statt. Es konnte gezeigt werden, das L. pneumophila in Leitungswasser und Mainwasser auserordentlich gut zu persistieren vermochte. Zudem konnte dokumentiert werden, das auch E. coli DH5a in ein lebensfahiges, aber nicht mehr kultivierbares Ruhestadium (viable but nonculturable, VBNC) eintreten kann. Parallel zur Ermittlung der CFU-Werte wurden wahrend des Verlaufs der Experimente die Lebendzellzahlen durch Fluoreszenzfarbungen bestimmt. Der Ubergang von L. pneumophila in das VBNC-Ruhestadium wurde zudem durch in situ - Hybridisierungen mit fluoreszenzmarkierten 16 S rRNA-Oligonukleotidsonden dokumentiert. Im Naturhaushalt spielt dieser Ubergang zu VBNC-Stadien bei Umweltbakterien zur Uberwindung ungunstiger Phasen eine grose Rolle. Schlieslich erfolgten Experimente zur Reaktivierung der VBNC-Ruhestadien. Diese Reaktivierung ist abhangig von speziesspezifischen Triggern und kann bei L. pneumophila durch Coinkubation mit Acanthamoeba castellanii erfolgen.