利用CRISPR/Cas9慢病毒载体构建敲除大鼠肝星状细胞COX-2基因的细胞模型

目的  通过构建CRISPR/Cas9慢病毒载体，转染HSC-T6细胞，获得能稳定表达Cas9蛋白的HSC-T6细胞和COX-2基因缺陷的HSC-T6-COX-2-/-细胞，为后期的功能研究提供良好的工具和手段，为临床上治疗肝纤维化提供新策略。 方法  设计合成COX-2基因特异性的sgRNA(COX-2-sgRNA-1、COX-2-sgRNA-2、COX-2-sgRNA-3)，并将其连接至GV371载体上，提取重组后的质粒，将其与包装质粒共同转染到293T细胞，形成慢病毒颗粒，荧光法检测病毒滴度。按照MOI值计算病毒最适用量，先将Lenti-Cas9-puro转染至HSC-T6细胞，嘌呤霉素筛选得到HSC-T6-Cas9细胞，再用Lenti-COX-2-sgRNA-EGFP转染至HSC-T6-Cas9细胞获得HSC-T6-COX-2-/-细胞，通过Cruiser酶切检测及Western Blot等方法在基因和蛋白水平上进行敲除验证。计量资料多组间比较采用方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。 结果  通过测序验证COX-2-sgRNA表达载体构建成功。重组表达质粒和包装质粒共同转染到293T细胞，形成慢病毒颗粒，荧光法检测病毒滴度均在1×108以上。成功构建能稳定传代的Cas9蛋白的HSC-T6细胞和COX-2基因缺陷的HSC-T6-COX-2-/-细胞模型。HSC-T6-Cas9细胞中LV-Cas9-Puro mRNA相对表达量(541.93±105.76)高于CON组细胞(1.00±0.02)，差异具有统计学意义(t=12.995，P＜0.01)。通过Cruiser酶切检测及Western Blot试验，结果提示CRISPR/Cas9慢病毒表达载体能在靶点起作用，其中COX-2-sgRNA-2敲除作用最明显，并且COX-2蛋白表达水平较CON组和NC组相比显著下降(P值均＜0.05)，提示COX-2-sgRNA有活性。 结论  成功构建了针对COX-2靶基因的CRISPR/Cas9慢病毒载体，获得稳定的COX-2基因敲除的HSC-T6-COX-2-/-细胞。