Análise funcional e fenotípica de células dendríticas caninas geradas in vitro e ativadas por diferentes estímulos biológicos – resultados parciais (projeto em andamento)

Os caes sao acometidos por doencas inflamatorias e neoplasicas que apresentam diversas similaridades com quadros registrados em seres humanos e se constituem em um importante modelo animal para a realizacao de investigacoes de patologia comparada. As celulas dendriticas (DCs), na atualidade, consideradas como a populacao mais potente de celulas apresentadoras de antigenos sao um alvo promissor para a imunoterapia de caes; no entanto o uso terapeutico de DC caninas ainda e limitado, pois as tecnicas de isolamento ainda nao foram padronizadas e as informacoes especificas da especie a esse respeito ainda sao insuficientes. O presente projeto foi delineado para avaliar a geracao in vitro de celulas dendriticas caninas pulsadas com diferentes doses de lisado tumoral (melanoma canino), bem como, de investigar os seus efeitos sobre a caracterizacao imunofenotipica e funcional de DCs maduras. Esta sendo empregado o buffy coat de bolsas de sangue caninas coletadas pelo Banco de Sangue do HOVET-USP, nas quais por meio de Ficoll 1077g/dL sao isolados linfomononucleares que darao origem as DCs apos cultivo celular com meio contendo citocinas recombinantes canina (GM-CSF) e interleucina 4 (IL-4). No setimo dia de cultivo as celulas do grupo controle e DCs sao incubadas com anticorpos MHC de classe II, CD11c, CD86, F4/80 e analisadas em citometro de fluxo FACScalibur. As celulas tumorais que dao origem ao extrato tumoral sao provenientes de melanomas caninos submetidos a digestao por colagenase e posteriormente congelados a -80o C na presenca de soro fetal bovino e DMSO; o lisado tumoral e obtido submetendo-se as celulas tumorais a ciclos de congelamento com nitrogenio liquido e descongelamento, seguida por sonicacao; a quantificacao de proteina obtida no extrato e dosada com o metodo Bradford; no quinto dia de cultivo DCs (DC imaturas) sao pulsadas com diferentes quantidades de lisado tumoral; no sexto dia e adicionado LPS para induzir maturacao nas DCs e no setimo dia e avaliada a imunofenotipagem. Ate o momento foram obtidos aproximadamente 65% de DCs imaturas e os experimentos de imunofenotipagem apos pulsar DCs com lisado tumoral se encontram em andamento.