Caracterização genômica da bactéria endossimbiótica do tripanosomatídeo Crithidia deanei e de suas DNA topoisomerases

O principal objeto de estudo do presente trabalho sao as DNA topoisomerases do tipo II do endossimbionte,devido ao seu papel essencial tanto nos processos replicacao e transcricao,como tambem na recombinacao e segregacao dos cromossomos bacterianos.Existem duas topoisomerases do tipo II em bacterias:a DNA girase e DNA topoisomerase IV. A DNA girase introduz superenovelamento negativo no DNA circular,enquanto a topo IV tem como sua principal funcao a decatenacao do DNA durante a segregacao dos cromossomos.Para esses estudos foi gerada uma biblioteca genomica do endossimbionte em pUC18 e sequenciados 7.500 clones inicialmente,abrangendo uma cobertura de 1,2 MB. As sequencias obtidas foram analisadas atraves do algoritmo BLAST.A analise mostrou que o genoma do endossimbionte apresenta uma grande homologia com os genomas de bacterias do genero Bordetella,mas diferem no conteudo A+T,que no genoma do endossimbionte e de aproximadamente 70por cento,enquanto que no genero Bordetella e de apenas 32por cento.Esta estrategia permitiu encontrar as sequencias dos genes que codificam as subunidades A(GyrA)e B(GyrB)da DNA girase. Identificamos tambem o gene que codifica a topoisomerase III(topo III),mas nao fomos capazes de identificar os genes que codificam as enzimas topo IV e I(topoisomerase I),que formam juntamente com a DNA girase e topo III o repertorio de topoisomerases encontrado em outras bacterias.Baseados nas sequencias dos genes gyrA e gyrB foram desenhados iniciadores para amplificacao dos alvos atraves de PCR.Os produtos das amplificacoes foram clonados para expressao em E.coli.As proteinas recombinantes foram purificadas para a producao de antissoros policlonais.Ensaio de western blot...preditas a partir da sequencia dos genes gyrA e gyrB.Analise por imunofluorescencia mostrou que os antissoros contra as subunidades A e B da DNA girase reconhecem antigenos especificos do endossimbionte,inoculados por todo o citoplasma da bacteria.Os genes gyrA e gyrB tambem...