Le complexe mediatophore et la liberation de l'acetylcholine dans la synapse nerf-electroplaque de la torpille. Etude biochimique de la structure quaternaire et role de la sous-unite proteolipidique

La transmission synaptique est un mecanisme fondamental du fonctionnement du systeme nerveux, qui permet le transfert de signaux entre les neurones au niveau des synapses. Dans le cas de la transmission chimique rapide, le signal utilise est une substance chimique, le transmetteur. La liberation de ce transmetteur dans la fente synaptique est un processus tres rapide (duree totale d'environ 100 s), dont le mecanisme moleculaire n'est pas encore parfaitement compris. Notre equipe, sous la direction de m. Israel, etudie le mecanisme de la liberation du transmetteur, l'acetylcholine (ach), dans l'organe electrique de la torpille. M. Israel et ses collaborateurs ont propose il y a quelques annees qu'une proteine specialisee, le mediatophore, effectue le transport du transmetteur a travers la membrane presynaptique. Les experiences decrites dans la premiere partie de cette these concernent la caracterisation de la structure quaternaire du mediatophore dans les terminaisons cholinergiques isolees (synaptosomes) de torpille. Nous avons utilise un anticorps monoclonal qui reconnait une sous-unite de cette proteine, le proteolipide de 15 kda. En premier lieu, nous avons confirme par immunochimie la presence du proteolipide de 15 kda dans la membrane presynaptique. La solubilisation des proteines synaptosomales dans des conditions non-denaturantes (detergent c #1#2e#9) montre que le proteolipide de 15 kda est associe a deux complexes proteiques distincts: une forme minoritaire de coefficient de sedimentation de 16 s et une forme majoritaire de 8,3 s. Le complexe de 16 s est l'atpase a protons de type vacuolaire (v-atpase), un composant de la membrane des vesicules synaptiques. La proportion du proteolipide associe au complexe de 8,3 s reflete la proportion associee specifiquement a la membrane presynaptique, ce qui suggere que le complexe de 8,3 s est le mediatophore. Nous avons montre en deuxieme lieu par des experiences de proteolyse et de traitement a ph 11 que le complexe de 8,3 s ne contient pas de sous-unites perimembranaires. Cependant, un traitement a ph 11 permet de dissocier ce complexe lorsque du nacl est ajoute avant le retour a ph 7 et la solubilisation. Le proteolipide de 15 kda se retrouve alors associe a une proteine plus legere (complexe de 6 s). Des experiences preliminaires suggerent que ce complexe de 6 s est un homo-decamere de proteolipide de 15 kda, en accord avec les observations microscopiques du mediatophore extrait en solvants organiques. D'autres traitements, comme la solubilisation a forte concentration de c #1#2e#9, entrainent aussi l'apparition de ce complexe de 6 s. Nous en avons conclu que le complexe de 8,3 s est forme par l'association d'un complexe de 6 s, contenant le proteolipide, et d'un autre composant membranaire non caracterise. En troisieme lieu, nous avons observe que lorsqu'un arn messager pur codant pour le proteolipide de 15 kda de torpille est injecte dans des ovocytes de xenope, le proteolipide de 15 kda biosynthetise est assemble sous forme d'un complexe de 6 s. Par contre, l'injection d'arn messagers extraits de neurones cholinergiques de torpille entraine l'apparition d'un complexe de 8,3 s. Ces resultats demontrent la nature hetero-oligomerique du mediatophore. La deuxieme partie de ce travail est une etude de l'effet du dicyclohexylcarbodiimide (dccd) sur la liberation d'ach. Le dccd est un reactif qui se lie de facon covalente au proteolipide de 15 kda en reagissant avec le residu glu#1#3#8. Comme ce proteolipide est une sous-unite commune au mediatophore et a la v-atpase, il est interessant d'analyser les effets du dccd sur l'activite de ces deux proteines. Nous avons montre que le dccd se lie effectivement au proteolipide de torpille aussi bien dans les vesicules qu'au niveau de la membrane presynaptique, et que l'incubation des synaptosomes avec le dccd provoque un blocage de la capture vesiculaire d'ach, vraisemblablement du a une inhibition de la v-atpase. La liberation d'ach synaptosomale n'est pas affectee par le dccd, a l'exception de celle de l'ach neo-synthetisee, qui est inhibee selon une cinetique comparable a l'inactivation de la capture vesiculaire. De plus, le dccd n'inhibe pas l'activite de liberation d'ach par le mediatophore reconstitue dans des liposomes. Par consequent, le blocage de la liberation d'ach neo-synthetisee vient de ce que le transmetteur n'est plus incorpore dans les vesicules synaptiques. La vesicule synaptique joue donc un role essentiel dans le mecanisme de la liberation. Dans la troisieme partie, nous exposons des resultats sur l'activite et la structure du mediatophore de rat. Nous avons observe que l'extrait organique de la zone innervee du muscle sternomastoidien de cet animal a une activite de transport d'ach comparable a celle observee chez la torpille, alors que l'extrait de la zone non-innervee en est depourvu. Nous avons aussi observe cette activite dans l'extrait organique du nerf sciatique. L'analyse de la compositi