ПОЛУЧЕНИЕ В Е. COLI И 19F-ЯMP ИССЛЕДОВАНИЕ 5-ФТОРТРИПТОФАНСОДЕРЖАЩЕГО N-КОНЦЕВОГО ДОМЕНА α-СУБЪЕДИНИЦЫ АЦЕТИЛХОЛИНОВОГО РЕЦЕПТОРА TORPEDO CALIFORNICA

С использованием соответствующего фрагмента кДНК и выращивания клеток Escherichia coli на синтетической среде с добавкой 5-фтортриптофана получен белок, отвечающий экстрацеллюлярному домену (остатки 1-209) α-субъединицы никотинового ацетилхолинового рецептора из электрического органа Torpedo californica. Наличие фрагмента (His)6, предшествующего последовательности 1-209, позволило провести очистку белка, выделенного из тел включения, на Ni-NTA-агарозе. Анализ гидролизата белка с помощью 19F-ЯМР показал, что включение остатков 5-фтортриптофана составило ~50%. Спектр белка, подвергнутого восстановлению в денатурирующих условиях и последующему реокислению в разбавленном растворе в присутствии 0.05% SDS, характеризуется достаточным разрешением, что позволило провести частичное отнесение сигналов 19F с использованием мутанта Trp60Phe. Способность полученных доменов специфически связывать α-нейротоксины змей показана с использованием радиоиодированного α-бунгаротоксина и трифторацетилированного α-кобратоксина.A protein corresponding to the extracellular 1-209 domain of the α-subunit of the nicotine acetylcholine receptor from the electric organ of Torpedo californica was prepared using the corresponding cDNA domain by culturing Escherichia coli cells on a synthetic medium supplemented with 5-fluoro-L-tryptophan. The presence of a (His)6 fragment preceding the 1-209 sequence allowed purification of the protein isolated from inclusion bodies by affinity chromatography on Ni-NTA Agarose. The incorporation of 5-fluorotryptophan residues was found by 19F NMR to be ~50%. The spectrum of the protein reduced under denaturing conditions and subsequently reoxidized in a dilute solution under denaturing conditions in the presence of 0.05% SDS was sufficiently resolved, which allowed partial assignment of 19F resonances using the Trp60Phe mutant protein. The ability of the prepared domains to specifically bind snake α-neurotoxins was demonstrated with the use of radioiodinated α-bungarotoxin and trifluoroacetylated α-cobratoxin.