rAAV2-hTGF-β1转染犬MSCs诱导分化为软骨细胞的研究

目的探讨rAAV2-hTGF-β1体外转染犬MSCs定向分化为软骨细胞的可行性。方法应用密度梯度离心法及贴壁筛选法分离培养犬MSCs。倒置显微镜及Giemsa染色观察细胞形态．流式细胞技术鉴定其表面标记物。取第三代MSCs，分别以感染复数（MOI）为1×10^5病毒基因数／细胞（v.g／cell）、5×10^5v．g．／cell的rAAV2-hTGF-β1进行转染。培养后定期取各组细胞进行相关检测。Western blot检测hTGF—β1的表达，ELISA法测定hTGF—β1的含量。RT-PCR检测Ⅱ型胶原、Aggrecan mRNA的表达，免疫细胞化学法检测Ⅱ型胶原的表达。结果原代及传代培养的MSCs呈梭形外观，具有较强的增殖能力。细胞表面抗原CD29、CD44、CD105表达阳性，CD34、CD45表达阴性。rAAV2-hTGF-β1转染MSCs后，Western blot法检测到目的蛋白hTGF—β1稳定表达；ELISA法检测转染组MSCs培养上清液中的hTGF-β1表达，且随时间的延长，各组hTGF—β1浓度逐渐增加，MOI5×10^5组表达量明显高于MOI1×10^5组（P〈0．01）；RT—PCR检测到各转染组Ⅱ型胶原、Aggrecan mRNA表达，免疫细胞化学法检测转染组细胞Ⅱ型胶原呈阳性表达，且高MOI值组表达强度明显高于低MOI值组。结论rAAV2-hTGF—β1转染犬MSCs后可定向分化为软骨细胞，作为软骨组织工程的种子细胞是可行的。