Detection of Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli in bean seeds by flow cytometry, immunostaining and direct viable counting

A combinacao do uso do citometro de fluxo (FCM) e de anticorpo policlonal (imuno-FCM) foi comparada a microscopia de imunofluorescencia (IF) e ao plaqueamento em meio de cultura semi-seletivo, para a deteccao de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli (Xap) em sementes de feijao. Concentracoes de Xap variando de 103 a 107 CFU/mL foram adicionados aos extratos de sementes. Um metodo de separacao pelo citometro de fluxo foi desenvolvido para a deteccao de Xap em extratos de semente e posterior confirmacao por PCR. Para avaliacao da viabilidade das celulas foram usadas sondas fluorescentes, iodeto de propidio (PI)/carboxi diacetato de fluoresceina (cFDA) e PI/SYTO 9 e tambem, a combinacao de imuno-FCM e PI. Em meio semi-seletivo e IF foram detectadas 103-106 UFC/mL e no FCM 104-106 UFC/mL, em extratos de sementes artificialmente infestados. Xap somente foi detectada em extratos de sementes por PCR, apos o processo de separacao pelo FCM. Foi possivel pelo FCM a quantificacao e identificacao de celulas viaveis (verde fluorescente) e celulas mortas (vermelho fluorescente) de Xap, pelas sondas cFDA/SYTO 9 e PI, respectivamente. A combinacao de immuno-FCM e PI podera ser uma tecnica promissora e segura para a deteccao deste patogeno em sementes.