Development of the method for determination of malondialdehyde in biological samples

Malondialdehid (MDA) u organizmu nastaje prilikom lipidne peroksidacije, odnosno kada reaktivni kisikovi spojevi poput peroksid i superoksid radikala razgrađuju visestruko nezasicene masne kiseline pri cemu nastaju razni aldehidi pa tako i MDA. MDA je organski spoj kemijske formule CH2(CHO)2, a u organizmu prevladava njegova enolna forma. Reaktivni je aldehid i jedan je od mnogih reaktivnih elektrofila koji može uzrokovati toksicni stres stanice. Također, MDA može stvarati kovalentne adukte s proteinima, ali i s DNA te se zbog toga smatra mutagenim. Koncentracija MDA u plazmi ukazuje nam na oksidativni stres organizma, a koncentracija MDA u pojedinom organu na oksidativni stres u tom organu. Metoda koja se najcesce koristi za određivanje koncentracije MDA u bioloskom uzorku je derivatizacija MDA s 2-tiobarbituratnom kiselinom (TBA) pri cemu MDA reagira s dva ekvivalenta TBA i nastaje MDA-(TBA)2 kompleks. Reakcija se odvija u kiselim uvjetima i na visokoj temperaturi pri cemu nastaje crveni fluorenscentni derivat MDA-(TBA)2 cija koncentracija se može izmjeriti spektrofotometrijski. Ta metoda je jednostavna, međutim nije specificna jer i druge tvari (ugljikohidrati, neke aminokiseline i pigmenti žuci) reagiraju s TBA. Metoda se može poboljsati koristenjem tekucinske kromatografije s UV detektorom (HPLC-UV/VIS), pri cemu se na analitickoj koloni razdvajaju kromogene supstance koje su reagirale s TBA. No, jos uvijek se smatra da su uvjeti derivatizacije MDA s TBA (niski pH i visoka temperaura) prestresni. Stoga je cilj naseg istraživanja bio pronaci uvjete pH i temperature prilikom derivatizacije MDA s TBA, koji ne bi bili stresni, a jos uvijek derivatizacija bila potpuna. Ispitivali smo razlicite dužine zagrijavanja uzorka (20, 30, 40, 60 i 80 minuta) te razlicite pH reakcijske smjese. Nasa ispitivanja proveli smo na HPLCu koji se sastojao od HPLC pumpe (model 64, Knauer, Berln, Njemacka), UV detektora (model UV-1, Knauer, Berlin, Njemacka), manualnog injektora s 100µl petljom i analiticke kolone dimenzija 125.0x4.0 mm s predkolonom 4.0x4.0 mm i velicinom punila 5 μm (LiChrospher RP-18, Merck, Darmstadt, Njemacka). Upotrijebili smo mobilnu fazu koja se sastojala od 50 mM KH2PO4 i metanola (60/40 ; v/v). Nasa ispitivanja pokazala su da je najoptimalnije pripremanje uzoraka takovo da se u 50 μl uzorka, standarda ili destilirane vode (slijepa proba) doda 400 μl fosforne kiseline (0.1%), 100 μl TBA (0.6%), pH te reakcijske smjese je 1, 94. Uzorci su potom promijesani i zagrijani u termobloku 30 minuta na 90oC. U takvim uvjetima reakcije imali smo zadovoljavajuci signal standarda. Tlak je bio oko 10 MPa, a vrijeme zadržavanja MDA-(TBA)2 na koloni oko 1, 5 minuta. Kako bi metodu validirali pripremili smo iz komercijalnog standarda MDA razrjeđivanjem standarde koncentracija 0, 15 ; 0, 75 ; 1, 5 ; 3 μM. Baždarni pravac bio je linearan, a faktor korelacije (r2) bio je 0, 993. Ponovljivost u seriji bila je 2, 9 %, a ponovljivost iz dana u dan 3, 6 %.