CRISPR/Cas9基因编辑技术构建靶向敲除小鼠微小RNA-101a基因的一体化载体系统

目的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建两种一体化载体，用于敲除AML12细胞系中的微小RNA（microRNA，miR）-101a。 方法设计三条小鼠靶向miR-101a基因的小向导RNA（sgRNA）以及一条靶向绿色荧光蛋白基因的sgRNA，分别构建至一体化载体系统（pENTRY-U6-sgRNA-EF1α-WT Cas9），并将sgRNA1和sgRNA3构建至一体化载体系统（pENTRY-U6-sgRNA-U6-sgRNA-EF1α-Cas9 D10A）。在AML12细胞系中转染构建的一体化质粒，72 h后用T7核酸内切酶Ⅰ（T7EⅠ）检测剪切效率。将pENTRY一体化质粒通过Gateway的方式重组到pAD载体中，再转染293A细胞进行腺病毒包装。在AML12细胞系中进行腺病毒感染，72 h后检测miR-101a成熟体的表达水平以评估敲除效率。 结果构建的pENTRY一体化质粒经测序鉴定后正确。质粒转染AML12细胞系后进行T7EⅠ检测，均发生了明显剪切形成了两条带，表明设计的sgRNA有效果。pENTRY一体化质粒重组到pAD载体中，经酶切鉴定正确。腺病毒转染AML12细胞系后，实时荧光定量PCR检测表明细胞中miR-101a成熟体表达水平较对照组均明显下降（均 P 结论构建了具有较高敲除效率的靶向小鼠miR-101a基因的一体化载体系统，为后续微小RNA功能研究奠定了技术支撑和实验基础，同时也为其他微小RNA敲除提供了借鉴方法。