Virus del moteado de la parietaria (PMoV): mecanismos de interacción del virus con la planta y caracterización de aislados virales

En el primer capitulo de esta Tesis se ha realizado un estudio de la variabilidad genetica y evolucion del virus del moteado de la parietaria (PMoV). El analisis filogenetico mostro que los aislados italianos se agrupaban en el clado I aislados espanoles se agrupaban en los clados II, III y IV. El aislado griego GrT-1 estudiado formaba parte del clado IV en el arbol filogenetico de la CP mientras que en el arbol filogenetico de la 2b aparecia como un aislado independiente. La diversidad nucleotidica de los genes que codifican para las proteinas 2b y CP fue baja, aunque mas alta que la observada en otros ilarvirus. La distribucion de las sustituciones sinonimas (S) y no sinonimas (N) revelo que las proteinas 2b y CP se encontraban bajo presion de seleccion purificadora, con unas pocas posiciones bajo seleccion diversificadora. Tambien se detectaron fenomenos de intercambio genetico entre algunos aislados espanoles, probablemente como resultado de reordenamientos entre los segmentos genomicos de estos. Se caracterizo biologica y molecularmente el aislado del PMoV T32. Se observo que T32 era un patotipo y genotipo diferente al aislado espanol CR8. El analisis de secuencia de los RNAs genomicos del aislado T32 y de las secuencias aminoacidicas de las proteinas mostro diferentes dominios conservados. La CP del aislado T32 tenia 16 aminoacidos menos que la CPs de los otros dos aislados italianos (Pe1 y ST-1) como consecuencia de la deleccion de un nucleotido (citosina). Finalmente, el analisis de las substituciones N y S indico que todas las regiones genomicas del aislado T32 estaban sometidas a una presion de seleccion negativa o purificadora. Posteriormente se estudio la implicacion de la proteina 3a (MP) de PMoV en el movimiento celula-a-celula del virus. Se observo la presencia de dos regiones hidrofilicas no contiguas (R1 y R2) con un alto contenido de aminoacidos basicos lisinas (K) y argininas (R) y una estructura secundaria en ?-helice. Ademas, se demostro que ambas regiones tenian capacidad de union al RNA de manera independiente. Mediante un analisis mutacional se observo que la perdida de los aminoacidos basicos de estas regiones interferia con el movimiento intercelular del virus. Los estudios de localizacion subcelular mostraron que la MP nativa de PMoV se localizaba en los PDs mientras que las MPs a las que se les habia quitado los aminoacidos basicos perdian parcial o totalmente la capacidad de localizarse en los PDs. Los ensayos llevados a cabo con una construccion recombinante que contenia el RNA 3 del virus del mosaico de la alfalfa (Alfalfa mosaic virus, AMV) y a la que se le habia reemplazado la MP por la del PMoV mostraron que la acumulacion de la MP en los PDs es esencial para el movimiento intercelular del virus. Finalmente, se estudio la implicacion de las proteinas 2b, MP y CP del PMoV en la patogenicidad del virus y el posible mecanismo de induccion de sintomas (factores de potogenicidad o avirulencia). Se observo que la CP de PMoV indujo fuertes sintomas de enanismo, mosaico y enrollado foliar en plantas de Nicotiana benthamiana, mientras que la MP y la 2b de PMoV indujeron unicamente sintomas de enrollado foliar y mosaico. El analisis para determinar si las proteinas CP, 2b y MP de PMoV eran supresores de silenciamiento genico (Viral suppressors of RNA silencing, VSRs), mediante una construccion genetica basada en la secuencia genetica del virus del arrugado del nabo (TCV) mostraron que ni la CP, MP ni la 2b de PMoV eran capaces de restablecer el movimiento de la construccion de TCV, sugiriendo que ninguna de ellas tenia actividad VSR.