Técnicas para extração de DNA de microorganismos da microbiota intestinal de Nyssomyia neivai (Diptera: Psychodidae, Phlebotominae)

Introducao: Os flebotomineos sao insetos vetores de patogenos. O protozoario Leishmania spp. (Kinetoplastida, Trypanosomatidae) e o agente etiologico das leishmanioses cutânea e visceral. Estima-se que essa zoonose acometa entre 900 000 e 1 200 000 de pessoas e que ocorram 600 000 novos casos por ano em 98 paises. Nyssomyia neivai e incriminada na transmissao da leishmaniose tegumentar em diferentes areas do Brasil. Ha poucos relatos sobre a microbiota intestinal de insetos hematofagos. O uso de tecnicas moleculares para identificacao de microorganismos em insetos tem sido utilizadas com relativo sucesso. Essas tecnicas podem ser aplicadas aquelas especies que sao cultivaveis em meios de cultura tradicionais e tambem aquelas nao cultivaveis, abrangendo um maior numero de especies de diferentes ambientes, como o trato intestinal de insetos. A metagenomica funciona a partir do isolamento do DNA, producao de bibliotecas de DNA, sequenciamento e analises filogeneticas em banco de dados. Uma etapa crucial e a obtencao do material genetico a ser amplificado. Objetivo: Avaliar tres metodologias de extracao de DNA: kit, perolas de vidro e nitrogenio liquido a partir de intestinos de Nyssomyia neivai. Metodologia: Os intestinos de 30 femeas de flebotomineos, selvagens e geracao F1 de laboratorio, foram dissecados, acondicionados em solucao tampao e mantidos em temperatura -80°C. O DNA foi extraido utilizando tres metodologias: kit de extracao de DNA, perolas de vidro e nitrogenio liquido. A posterior amplificacao do material genetico foi feita com primers para regioes conservadas de DNA ribossomal de microorganismos (bacterias, protozoarios e fungos). Resultados e discussao: Para as tres metodologias avaliadas foram obtidos geis de agarose apenas para o grupo de protozoarios. Bacterias e fungos podem nao estar presentes nas amostras, ou estavam em quantidades insuficientes para serem detectados com essas metodologias. Conclusao: As tres metodologia sutilizadas detectam DNA de protozoarios. Novos testes serao desenvolvidos para melhoria da tecnica e obtencao de DNA de fungos e bacterias.v